Spektrofotometer | Instrumen di Laboratorium Medis

Table of Contents

 

http://www.slideshare.net

Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang di transmisikan atau yang di absorpsi.
 

Pada umumnya ada beberapa jenis spektrofotometri yang sering digunakan dalam analisis secara kimiawi, antara lain:
a. Spektrofotometri Vis (visibel)
b. Spektrofotometri UV (ultra violet)
c.  Spektrofotometer UV-VIS
Dan lain-lain tetapi yang akan dibahas dalam makalah ini adalah spektrofotometri UV-VIS, tetapi untuk lebih jelasnya akan dijelaskan terlebih dahulu secara singkat spektrofotometri di atas
 

Spektrofotometri Visibel

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak(visible).
 

Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.
 

Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.
 

Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan stabil.
 

 Spektrofotometri UV

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. 

Bening dan transparan.Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.

Spektrofotometri UV-VIS
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. Spektroskopi ultraviolet-visible atau spektrofotometri ultraviolet-visible (UV-Vis atau UV / Vis) melibatkan spektroskopi dari foton dalam daerah UV-terlihat. Ini berarti menggunakan cahaya dalam terlihat dan berdekatan (dekat ultraviolet (UV) dan dekat dengan inframerah (NIR)) kisaran. 

http://biosmlabindustri.blogspot.co.id

 Penyerapan dalam rentang yang terlihat secara langsung mempengaruhi warna bahan kimia yang terlibat. Di wilayah ini dari spektrum elektromagnetik, molekul mengalami transisi elektronik. Teknik ini melengkapi fluoresensi spektroskopi, di fluoresensi berkaitan dengan transisi dari ground state ke eksited state.
Penyerapan sinar uv dan sinar tampak oleh molekul, melalui 3 proses yaitu :
a. Penyerapan oleh transisi electron ikatan dan electron anti ikatan.
b. Penyerapan oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks
c.   Penyerapan oleh  perpindahan muatan.

Interaksi antara energy cahaya dan molekul dapat digambarkan sbb :
E = hv
Dimana , E = energy (joule/second)
h = tetapan plank
v = frekuensi foton
 

Penyerapan sinar uv-vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional/gugus kromofor (gugus  dengan ikatan tidak jenuh) yang mengandung electron valensi dengan tingkat eksitasi yang rendah. Dengan melibatkan 3 jenis electron yaitu : sigma, phi dan non bonding electron. Kromofor-kromofor organic seperti karbonil, alken, azo, nitrat dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimalnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elekron bebas, seperti hidroksil, metoksi dan amina. Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar (bathokromik) yang disertai dengan peningkatan intensitas (hyperkromik).
 

1.      Kegunaan spektroskopi UV-VIS
UV / Vis spektroskopi secara rutin digunakan dalam kuantitatif penentuan larutan dari logam transisi ion dan sangat dikonjugasikan senyawa organik. 
 

a. Larutan ion logam transisi dapat berwarna (misalnya, menyerap cahaya) karena elektron dalam atom logam dapat tertarik dari satu negara elektronik lainnya. Warna larutan ion logam sangat dipengaruhi oleh kehadiran spesies lain, seperti anion tertentu atau ligan. Sebagai contoh, warna larutan encer tembaga sulfat adalah biru yang sangat terang; menambahkan amonia meningkat dan perubahan warna panjang gelombang serapan maksimum (λ m a x). 
 

b. Senyawa organik, terutama mereka yang memiliki tingkat tinggi konjugasi, juga menyerap cahaya pada daerah UV atau terlihat dari spektrum elektromagnetik. Pelarut untuk penentuan ini sering air untuk senyawa larut dalam air, atau etanol untuk senyawa organik yang larut. (Pelarut organik mungkin memiliki penyerapan sinar UV yang signifikan; tidak semua pelarut yang cocok untuk digunakan dalam spektroskopi UV. Ethanol menyerap sangat lemah di paling panjang gelombang.).Polaritas pelarut dan pH dapat mempengaruhi penyerapan spektrum senyawa organik. Tirosin, misalnya, peningkatan penyerapan maksimum dan koefisien molar kepunahan ketika pH meningkat 6-13 atau ketika polaritas pelarut berkurang. 
 

c. Sementara kompleks transfer biaya juga menimbulkan warna, warna sering terlalu kuat untuk digunakan dalam pengukuran kuantitatif. Hukum Beer-Lambert menyatakan bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi spesies menyerap dalam larutan dan panjang jalan. Jadi, untuk tetap jalan panjang, UV / VIS spektroskopi dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi dalam larutan penyerap. Perlu untuk mengetahui seberapa cepat perubahan absorbansi dengan konsentrasi. Ini dapat diambil   dari referensi (tabel koefisien molar kepunahan), atau lebih tepatnya, ditentukan dari kurva kalibrasi.
Instrumentasi UV-Vis
 

Spektroskofi UV-VIS memiliki instrumentasi yang terdiri dari lima komponen utama, yaitu ;
 

1. Sumber radiasi
sumber energy cahaya yang biasa untuk daerah tampak dari spectrum itu maupun daerah ultraviolet dekat dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat ranbut terbuat dari wolfram. Pada kondisi operasi biasa, keluaran lampu wolfram ini memadai dari sekitar 235 atau 350 nm ke sekitar 3 µm. energy yang dipancarkan olah kawat yang dipanaskan itu beraneka ragam menurut panjang gelombangnya. Panas dari lampu wolfram dapat merepotkan; sringkali rumah lampu itu diselubungi air atau didinginkan dengan suatu penghembus angin untuk mencegah agar sampel ataupun komponen lain dari instrument itu menjadi hangat.
 

2.  Wadah sampel
kebanyakan spektrofotometri melibatkan larutan dan karenanyan kebanyakan wadah sampel adalah sel untuk menaruh cairan ke dalam berkas cahaya spektrofotometer. Sel itu haruslah meneruskan energy cahaya dalam daerah spektral yang diminati: jadi sel kaca melayani daerah tampak, sel kuarsa atau kaca silica tinggi istimewa untuk daerah ultraviolet. Dalam instrument, tabung reaksi silindris kadang-kadang diginakan sebagai wadah sampel. Penting bahwa tabung-tabung semacam itu diletakkan secara reprodusibel dengan membubuhkan tanda pada salah satu sisi tabunga dan tanda itu selalu tetaparahnya tiap kali ditaruh dalam instrument. Sel-sel lebih baik bila permukaan optisnya datar. Sel-sel harus diisi sedemikian rupa sehingga berkas cahaya menembus larutan, dengan meniscus terletak seluruhnya diatas berkas. Umumnya sel-sel ditahan pada posisinya dengan desain kinematik dari pemegangnya atau dengan jepitan berpegas yang memastikan bahwa posisi tabung dalam ruang sel (dari) instrument itu reprodusibel.
 

3. Monokromator
Monokromator ini adalah piranti optis untuk memencilkan suatu berkas radiasi dari sumber berkesinambungan, berkas mana mempunyai kemurnian spectral yang tinggi dengan panjang gelombang yang diinginkan. Radiasi dari sumber difokuskan ke celah masuk, kemudian disejajarkan oleh sebuah lensa atau cermin sehingga suatu berkas sejajar jatuh ke unsure pendispersi, yang berupa prisma atau suatu kisi difraksi. Dengan memutar prisma atau kisi itu secara mekanis, aneka porsi spectrum yang dihasilkan oleh insur disperse dipusatkan pada celah keluar, dari situ, lewat jalan optis lebih jauh, porsi-porsi itu menjumpai sampel.
 

4. Detektor
Detector dapat memberikan respons terhadap radiasi pada berbagai panjang gelombang Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet. Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap. Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV. Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.
 

5. Rekorder
Dan di dalam rekorder signal tersebut direkam sebagai spektrum yang berbentuk puncak-puncak. Spektrum absorpsi merupakan plot antara absorbans sebagai ordinat dan panjang gelombang sebagai absis.


Prinsip Kerja UV-Vis
Pada prinsipnya spektroskopi UV-Vis menggunakan cahaya sebagai tenaga yang mempengaruhi substansi senyawa kimia sehingga menimbulkan cahaya.Cahaya yang digunakan merupakan foton yang bergetar dan menjalar secara lurus dan merupakan tenaga listrik dan magnet yang keduanya saling tagak lurus. Tenaga foton bila mmepengaruhi senyawa kimia, maka akan menimbulkan tanggapan (respon), sedangkan respon yang timbul untuk senyawa organik ini hanya respon fisika atau Physical event. Tetapi bila sampai menguraikan senyawa kimia maka dapat terjadi peruraian senyawa tersebut menjadi molekul yang lebih kecil atau hanya menjadi radikal yang dinamakan peristiwa kimia atau Chemical event.

Spektroskopi UV-Vis digunakan untuk cairan berwarna. Sehingga sampel yang akan diidentifikasi harus diubah dalam senyawa kompleks. Analisis unsur berasal dari jaringan tanaman, hewan, manusia harus diubah dalam bentuk larutan, misalnya destruksi campuran asam (H2SO4+ HNO3 + HClO4) pada suhu tinggi. Larutan sample diperoleh dilakukan preparasi tahap berikutnya dengan pereaksi tertentu untuk memisahkan unsur satu dengan lainya, misal analisis Pb dengan ekstraksi dithizon pada pH tertentu. Sampel Pb direaksikan dengan amonium sitrat dan natriun fosfit, pH disesuaikan dengan penambahan amonium hidroksida kemudian ditambah KCN dan NH2OH.HCl dan ekstraksi dengan dithizon.

Cara kerja alat spektrofotometer UV-Vis yaitu sinar dari sumber radiasi diteruskan menuju monokromator, Cahaya dari monokromator diarahkan terpisah melalui sampel dengan sebuah cermin berotasi, Detektor menerima cahaya dari sampel secara bergantian secara berulang – ulang, Sinyal listrik dari detektor diproses, diubah ke digital dan dilihat hasilnya, perhitungan dilakukan dengan komputer yang sudah terprogram.
Aplikasi dari UV-Vis
 

1. Studi Fotoelektrokimia Lapisan Tipis CdS Hasil Deposisi Metode CBD
Lapisan tipis CdS dideposisi pada substrat gelas berlapis TCO dengan metode CBD (Chemical Bath Deposition) menggunakan bahan dasar CdCl2 sebagai sumber ion Cd2+ dan (NH2)2 SC (Thiourea) sebagai sumber ion S2-. Karakterisasi XRD lapisan tipis yang diperoleh memperlihatkan puncak-puncak karakteristik CdS polikristal dengan struktur kubik (zincblende). Absorbansi dan transmitansi optik dengan spektroskopi UV-VIS memperlihatkan daerah absorbsi pada rentang cahaya tampak (300 nm - 500 nm) dengan maksimum pada sekitar 330 nm. Karakterisasi fotoelektrokimia dilakukan di dalam sel elektrokimia yang berisi elektrolit 1M NaOH dan elektrolit mengandung kompleks iodida. Respon arus foto (photocurrent) elektroda CdS di dalam sel fotoelektrokimia memperlihatkan kebergantungan pada panjang gelombang cahaya datang dan bersesuaian dengan absorbansi optik spektroskopi UV-VIS. Lebar celah pita energi (energy bandgap) ditentukan melalui kurva (Jphhv)2 vs hv (energi foton), diperoleh lebar pita energi sebesar 2.45 eV. Hubungan rapat arus foto terhadap energi foton cahaya (hv) juga diperlihatkan dari kurva Jph vs hv.

2.Meneliti Pengaruh Kelembaban Terhadap Absorbansi Optik Lapisan Gelatin
Penelitian ini menyajikan studi tentang pengaruh kelembaban terhadap absorbansi optik lapisan gelatin. Cahaya yang melewati atau diserap film gelatin dideteksi menggunakan spektrometer dengan panjang gelombang antara 292 nm sampai 591 nm dalam rentang daerah ultraungu (UV) – cahaya tampak (visible). Absorbansi optik lapisan gelatin dipindai (di-scan) dengan perlakuan variasi kelembaban udara (kelembaban nisbi, RH). Film gelatin dideposisi menggunakan spin-coater pada kecepatan putar tertentu di atas substrat kaca

Sumber :

Kimia. 2016. Kimia analisa instrument. Diakses tanggal 15 Agustus 2016. Link ; http://nadinlove.blogspot.co.id/2012/03/kimia-analisa-instrument.html