Teknik Pewarnaan Gram | WHO

Table of Contents

Teknik Pewarnaan GRAM
Pewarnaan Gram mempermudah pemeriksaan mikroskopik apusan untuk mendeteksi bakteri, pus, basil Vincent, dan Candida albicans. Bakteri komensal, yang selalu ditemukan, tidaklah signifikan. Bakteri komensal ini tidak perlu diperiksa lebih lanjut ataupun dilaporkan.

 Prinsip
•    Ungu kristal mewarnai semua bakteri menjadi ungu tua.
•    Larutan iodin menahan zat warna violet secara lebih kuat atau lemah, tergantung jenis bakterinya.
•    Etanol 95% ;
     o    Memudarkan warna bakteri ketika ungukristal tidak terikatkuat oleh larutan iodin.
     o    Tidak memudarkan warna bakteri ketika ungukristal terikat kuat oleh laruta iodin.
•    Larutan fuksin karbol, merah netral, atau safranin (berwarna pin);
    o    Mewarnai ulang (pink) bakteri yang warnanya dipudarkan oleh etanol.
   o    Tidak berpengaruh terhadap bakteri yang tetap berwarna ungu tua (tidak dipudarkan oleh etanol).

Alat dan Bahan

• Mikroskop
• Rak kaca objek
• Ungu kristal, modifikasi Hucker.
• Larutan iodin lugol 0,1%
• Larutan pemudar-warna aseton-etanol
• Larutan fuksin karbol untuk pewarnaan Ziehl-Neelsen (diencerkan 10 kali dengan etanol 95%), larutan merah netral 0,2%, atau larutan safranin.

Metode  

1. Fiksasi apusan. Kalau apusan benar - benar sudah kering, fiksasi apusan dengan menambahkan beberapa tetes metanol 70% pada apusan selama 2 menit atau dengan melewatkan sebentar permukaan belakang kaca objek diatas api sebanyak tiga kali. Apusan yang sudah difiksasi dapat segera dipulas. Kadang - kadang, Anda perlu membuat sebuah lingkaran di sekeliling apusan dengan pensil minya (grease pencil), sehingga apusan ini lebih mudah dilihat.
2. Tambahkan ungu kristal pada keseluruhan kaca objek selama 60 detik.
3. Bilas dengan air bersih. Biarkan kaca objek mengering sebentar; selanjutnya, tambahkan iodin pada keseluruhan kaca objek selama 60 detik. 
4. Bilas dengan air bersih. Pudarkan warna segera dengan aseton-etanol, selama 2-3 detik saja.
5. Tambahkan fuksin karbol pada keseluruhan kaca objek selama 2 menit.
6. Bilas dengan airbersih dan taruh kaca objek, dengan posisi tegak, didalam rak kaca objek dan biarkan mengering.

Pemeriksaan Mikroskopik
Pertama - tama, amati preparat dengan objektif x40 untuk melihat distribusi pulasan; selanjutnya, pakai objektif x100 (dengan minyak imersi).

Organisme positif-Gram
Organismes positif-Gram terwarnai ungu tua (Mis., Stafilokokus, mikrokokus, pneumokokus, enterokokus, basil difteri, basil antraks).

Organisme negatif-Gram
Organisme negatif-Gram terwarnai merah. (Mis., gonokokus, meningokokus, basil koliform, shigella, vibrio kolera).

Identifikasi Organisme Spesifik
Candida albicans terlihat sebagai spora positif-Gram berukuran besar, berbentuk oval atau bulat, dengan berbagai filamen miri-miselium yang panjangnyabervariasi dan ujungnya membulat.

"Actinomycetes" terlihat sebagai granula besar, kadang - kadang tampak dengan mata telanjang (berwarna putih sampai kuning). Bagian tengahnya bersifat negatif-Gram, sementara bagian tepinya bersifat positif-Gram. Organisme ini ditemukan di dalam pus dari lesi kulit, sputum, dll.

Basil Vincent terlihat sebagai hasilfusiformis dan spirokaeta negatif-Gram.

Tidak ada lagi bakteri lain yang harus dilaporkan, mengingat banyak bakteri komensal yang sering dikira bakteri patogen.

Sumber kesalahan Identifikasi

• Reaksi positif-Gram palsu dapat terjadi karena :
• Apusan difiksasi sebelum benar - benar kering.
• Apusan terlalu tebal.
• Terdapat endapat di botol berisi ungu kristal (sering dulu sebelum dipakai).
• Larutan iodin tidak terbilas sempurna sewaktu pewarnaan.
• Preparat kurang lama dicelupkan ke dalam aseton-etanol.
• Larutan fuksin karbol (atau safranin atau merah neutral) yang dipakai terlalu pekat atau terlalu lama dibiarkan pada preparat.

Reaksi negatif-Gram palsu dapat terjadi karena :

• Preparat kurang lama diwarnai dengan laurat iodin.
• Preparat terlalu lama dicelupkan ke dalam aseton - etanol atau larutan ini tidak terbilas sempurna sewaktu pewarnaan.

Baca juga :

• Pewarnaan BTA (Bakteri Tahan Asam) - Seri Edukasi Teknologi Laboratorium Medik
•  Perkembangan Teknik dan Cara Kerja di Laboratorium Mikrobiologi - Seri Edukasi Teknologi Laboratorium Medik  
•  Sejarah Mikrobiologi - Seri Edukasi Tenaga Laboratorium Medik

PENTING : Terimakasih sudah berkunjung ke website Kami. Untuk yang mengambil artikel dari website Kami, dimohon untuk mencantumkan sumber pada tulisan / artikel yang Anda muat. Terimakasih atas kunjungannya.

Sumber :
WHO. (2003). Pedoman Teknik Dasar Untuk Laboratorium Kesehatan ; Edisi 2.  Hal ; 194 – 196. Alih Bahasa Chairlan dan Lestari. Jakarta ; Penerbit Buku Kedokteran EGC.