Mikrobiologi : Pewarnaan Mikroba
Table of Contents
Mikrobiologi : Pewarnaan Mikroba. Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah diidentifikasi harus menggunakan metode-metode tertentu. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya melalui reaksi dinding sel bakteri.
Salah satu cara yang digunakan untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme adalah dengan teknik pewarnaan Gram yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi. Untuk pengamatan morfologi mikroskopik mikroorganisme dengan sifatnya yang khas dapat menggunakan pewarnaan tertentu (pewarnaan Gram) sebagai identifikasi awal. Metode pewarnaan ini pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pewarnaan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel.
Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yang mengandung zat pati dan granula fosfat.
Berdasarkan hal tersebut di atas, maka dilakukanlah praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pewarnaan sederhana, pewarnaan negatif maupun pewarnaan gram serta mengetahui morfologi mikroorganisme. Faktor-faktor penentu keberhasilan di dalam pewarnaan mikroba adalah Fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan zat warna penutup/warna tandingan.
Ada beberapa jenis teknik pewarnaan yang paling sering digunakan dalam mengidentifikasi bentuk-bentuk morfologi dari mikroorganisme, diantaranya:
Pewarnaan Negatif
Pewarnaan ini ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, pada metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai lingkungan sekitarnya karena pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat asam seperti eosin atau nigrosin.
Pewarnaan Sederhana
Metode ini merupakan proses pewarnaan yang paling umum digunakan. Pada metode ini hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai. Pewarnaan dilakukan dengan memakai satu macam larutan cat.
Pewarnaan Gram
Pewarnaan ini dikembangkan oleh Christian Gram (1884) dan populer dengan istilah pewarnaan Gram. Pewarnaan ini meliputi beberapa tingkatan yaitu:
Pewarnaan Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.
Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak bewarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat warna air tochsin atau safranin akan tampak merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan struktur kimiawi dinding selnya.
Pewarnaan Spora
Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan terhadap panas dan bahan kimia. Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang tidak menguntungkan bagi bakteri. Contoh bakteri yang membentuk spora adalah Bacillus, Clostridium, Thermactinomyces dan sporosacina. Spora terbentuk di dalam sel sehingga disebut sebagai endospora. Dalam sel bakteri hanya terdapat satu spora.
Dalam lingkungan yang menguntungkan spora bergerminasi kembali menjadi sel vegetative, jika lingkungan tidak memungkinkan maka sel vegetative aka berubah menjadi spora.
Alat dan Bahan Praktikum
Alat Praktikum
1. Tabung;
2. Rak tabung reaksi;
3. Bunsen;
4. Mikroskop;
5. Objek glass;
6. Cover glass;
7. Tissue;
8. Jarum ose;
9. Wadah pengering;
Bahan Praktikum
1. Escherichia coli;
2. Bacillus subtilis;
3. Staphylococcus aereus;
4. Kristal violet, iodine, safranin, alkohol, Malachit Green; Akuades.
Cara kerja:
I. Pewarnaan Negatif
- Bersihkan kaca objek dan kaca penutup dengan alkohol 70%, sterilkan dengan melewatkan di atas bunsen atau lampu spiritus beberapa kali
- Buat olesan tipis bakteri pada salah satu sudut kaca objek dengan mengambil isolat bakteri Bacillus cereus/Bacillus subtilis menggunakan jarum ose. (lakukan tahap ini secara aseptik)
- Lakukan pewarnaan negatif dengan mengambil 1-2 tetes nigrosin lalu dicampurkan. Dengan menggunakan gelas objek lain, sentuhkan sisi objek gelas tadi hingga membentuk sudut 45° tarik objek gelas tersebut ke arah berlawanan sehingga membentuk film tipis. Biarkan mengering dengan cara dianginkan, jangan difiksasi pada nyala api Bunsen
- Setelah kering, amati di bawah mikroskop.
II. Pewarnaan Sederhana
- Bersihkan kaca preparat dengan alkohol 70%
- Ambil 1 ose biakan (Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus) dan ratakan di atas kaca preparat (lakukan tahap ini secara aseptic)
- Kengeringkan dengan cara dilewatkan di atas lampu bunsen
- Lakukan pewarnaan dengan larutan Methylen blue atau Kristal violet 1-2 tetes
- Biarkan selama 2 menit, lalu bilas di bawah air yang mengalir sampai sisa-sisa cat hilang
- Lakukan fiksasi di udara, setelah kering amati hasilnya di bawah mikroskop, dan gambar hasil pengamatan.
III. Pewarnaan Gram
- Siapkan biakan mumi Staphylococcus aureus dan E. coil pada medium NA berumur 24 jam, gelas benda, akuades steril, larutan kristal violet (Gram A), larutan iodium (Gram B), Alkohol aseton (Gram C), Larutan safranin (Gram D), alkohol 70% dan pembakar bunsen.
- Lakukan pewarnaan Gram dengan cara menyiapkan olesan bakteri, fiksasi dengan bunsen. Teteskan Gram A sebanyak 2-3 tetes pada olesan bakteri, biarkan selama 1 menit. Cuci dengan air yang mengalir, keringkan dengan kertas isap secara hati-hati.
- Teteskan larutan Gram B, biarkan satu menit, cuci dengan air dan keringkan.
- Tetesi larutan Gram C biarkan selama 30 detik, cuci dengan air dan keringkan.
- Tetesi dengà n Gram D, biarkan selama 30 detik, cuci dengan air dan keringkan dengan kertas isap. Amati dibawah mikroskop.
IV. Pewarnaan spora
- Sediakan kaca benda yang bersih lalu lewatkan diatas api Bunsen
- Teteskan aquades di sudut atas kaca benda
- Secara aseptik inokulasi biakan bakteri yang akan diamati diatas tetesan aquades kemudaian ratakan perlahan-lahan
- Ambillah kaca benda lain lalu letakkan diatas kaca benda sediaan tersebut hingga membentuk sudut 45o
- Geserkan kaca benda kesudut lainnya sehingga sediaan menjadi rata, biarkan sampai mongering
- Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan di atas api Bunsen dengan cepat
- Teteskan larutan malachite green di atas sediaan lalu panaskan sediaan di atas api Bunsen. Perhatikan jangan sampai sediaan mendidih atau mongering. Selama melakukan pemanasan gunakan gunakan pinset untuk menjepit
- Jika sediaan sudah dingin, bilas dengan air keran yang mengalir
- Teteskan larutan safranin diatas sediaan tersebut dan biarkan selama 3 menit
- Setelah 3 menit bilas dengan air yang mengalir
- Keringkan sediaan dengan kertas penghisap atau dengan cara dianginkan dan amatilah di bawah mikroskop
- Catat dan gambarlah hasil pengamatan anda.
PENTING : Terimakasih sudah berkunjung ke website infolabmed.com. Jika Anda mengutip dan atau mengambil keseluruhan artikel dalam websit ini, mohon untuk selalu mencantumkan sumber pada tulisan / artikel yang telah Anda buat. Kerjasama/media partner : laboratorium.medik@gmail.com.
