Estimasi Hemoglobin (HGB/Hb)

Table of Contents

Estimasi Hemoglobin (HGB/Hb). Hemoglobin membawa oksigen dari paru-paru ke jaringan dan karbon dioksida dari jaringan ke paru-paru. Ini terdiri dari rantai polipeptida heme (besi + protoporphyrin) dan globin. Hemoglobin tidak homogen dan biasanya terdapat varian dan turunan yang berbeda. Varian hemoglobin normal adalah hemoglobin embrionik (Gower I, Gower II, dan Portland), hemoglobin janin (Hb F), hemoglobin dewasa (Hb A), dan Hb A2. Keduanya berbeda satu sama lain dalam jenis rantai polipeptida.

INDIKASI ESTIMASI HEMOGLOBIN

1. Untuk menentukan ada dan beratnya anemia: Anemia mengacu pada konsentrasi hemoglobin yang rendah atau kapasitas pembawa oksigen dalam darah. Tanda-tanda klinis anemia (kulit pucat, pembuluh konjungtiva, atau selaput lendir) tidak dapat diandalkan untuk diagnosis anemia. Anemia paling baik dinilai dengan estimasi hemoglobin atau volume sel yang dikemas.
2. Skrining untuk polycythemia: Polycythemia mengacu pada peningkatan kadar hemoglobin di atas kisaran normal. Ini mungkin primer, sekunder, atau relatif (Kotak 18.2).
3. Untuk menilai respons terhadap terapi spesifik pada anemia.
4. Estimasi indeks sel darah merah (bersama dengan volume sel yang dikemas dan jumlah sel darah merah) yaitu rata-rata hemoglobin sel dan konsentrasi hemoglobin sel rata-rata.
5. Pemilihan donor darah.

METODE ESTIMASI HEMOGLOBIN

Ada berbagai metode untuk memperkirakan hemoglobin. Ini adalah:

1. Metode kolorimetri: Dalam metode ini, perbandingan warna dilakukan antara standar dan sampel uji, baik secara visual atau dengan metode kolorimetri.

• Metode visual: Grafik Tallqvist, metode hematin asam Sahli, dan skala warna hemoglobin WHO.
• Metode fotolistrik: metode Cyanmethemoglobin (hemiglobincyanide), metode oksihemoglobin, dan metode hematin basa.

2. Metode gasometrik: Kapasitas pengangkut oksigen darah diukur dengan peralatan Van Slyke. Jumlah hemoglobin kemudian diturunkan dari rumus bahwa 1 gram hemoglobin membawa 1,34 ml oksigen. Namun, metode ini hanya mengukur hemoglobin aktif secara fisiologis, yang dapat membawa oksigen. Itu tidak mengukur karboksihemoglobin, sulfhemoglobin, dan methemoglobin. Selain itu, metode ini memakan waktu dan mahal. Hasilnya sekitar 2% lebih sedikit dari metode lain.

3. Metode kimiawi: Kadar besi hemoglobin diperkirakan pertama kali. Nilai hemoglobin kemudian diturunkan secara tidak langsung dari rumus bahwa dalam 100 gram hemoglobin mengandung 374 mg zat besi. Metode ini membosankan dan memakan waktu.

4. Metode berat jenis: Perkiraan kasar hemoglobin diperoleh dari berat jenis darah seperti yang ditentukan dari teknik tembaga sulfat. Cara ini berguna dalam skrining massal seperti pemilihan donor darah.

Bagan Hemoglobin Tallqvist

Bagan hemoglobin Tallqvist terdiri dari serangkaian warna litograf yang dikatakan sesuai dengan nilai hemoglobin mulai dari 10 hingga 100%. Setetes darah yang diperoleh dengan tusukan jari ditempatkan di selembar kertas penyerap. Warna yang dihasilkan dicocokkan dengan warna pada bagan dan pembacaan yang sesuai diambil. Meskipun metode ini murah dan sederhana, margin of error 20-50%.

Metode Asam Hematin Sahli

Prinsip: Darah dicampur dengan larutan asam sehingga hemoglobin diubah menjadi asam hematin berwarna coklat. Ini kemudian diencerkan dengan air sampai warna coklat sesuai dengan standar gelas coklat. Nilai hemoglobin dibaca langsung dari skala.

Sahli’s hemoglobinometer

Peralatan (Gbr 18.1)

1. Hemoglobinometer Sahli: Ini terdiri dari tabung hemoglobin lulus Sahli (ditandai dalam gram dan persen) dan pembanding dengan standar kaca coklat.
2. Pipet Sahli atau pipet hemoglobin (diberi tanda pada 20 μl atau 0,02 ml).
3. Batang kaca kecil (pengaduk).
4. Pipet tetes.

Reagen

1. N / 10 asam klorida
2.  Air suling

Spesimen: darah vena dengan antikoagulan EDTA atau darah yang diperoleh dengan tusukan kulit.

Metode

1. Tempatkan N / 10 asam klorida ke dalam tabung hemoglobin Sahli sampai tanda 2 gram.
2. Ambil sampel darah di pipet Sahli tepat sampai tanda 20 μl. Darah yang menempel pada bagian luar pipet diseka menggunakan kertas penyerap atau kain kasa.
3. Tambahkan sampel darah ke larutan asam, campur dengan pengaduk gelas, dan diamkan selama 10 menit.
4.  Tambahkan air suling setetes demi setetes sampai warna larutan sesuai dengan standar gelas coklat.
5. Lakukan pembacaan meniskus bawah dari tabung ukur dalam gram.

Catatan:

1. Meskipun tabung pengukur ditandai dengan angka gram dan persen, hasilnya harus selalu dilaporkan dalam gram. Hal ini karena (a) tidak ada nilai hemoglobin tunggal yang dapat dianggap 100% karena nilai tersebut bervariasi sesuai dengan usia dan jenis kelamin individu dan ketinggian, dan (b) hemoglobinometer dari produsen yang berbeda memiliki nilai yang berbeda sebagai 100%, sehingga sampel yang sama dari darah akan memberikan hasil yang berbeda pada instrumen yang berbeda.

2. Kekurangan metode Sahli:

• Sekitar 95% warna hematin asam dicapai pada akhir 10 menit. Untuk pengembangan warna yang maksimal, dibutuhkan waktu yang lebih lama (1 jam).
• Pencocokan sempurna dengan standar kaca coklat tidak dimungkinkan.
• Karboksihemoglobin, methemoglobin, dan sulfhemoglobin tidak diubah menjadi hematin asam. HbF juga tidak diubah menjadi hematin asam dan oleh karena itu metode ini tidak cocok untuk bayi kecil.
• Perkembangan warna lambat dan larutan hematin asam tidak stabil.
• Sumber cahaya (siang hari atau buatan) akan mempengaruhi perbandingan warna secara visual.
• Kesalahan pribadi dalam mencocokkan standar kaca coklat dengan larutan uji adalah 10%.
• Warna standar kaca coklat memudar seiring waktu.

Skala Warna Hemoglobin WHO

Skala warna hemoglobin WHO 

Metode ini, yang dibuat oleh Stott dan Lewis (1995), pada prinsipnya mirip dengan metode Tallqvist yang sekarang sudah usang. Modifikasi teknis tertentu telah dilakukan untuk meningkatkan akurasi dan keandalan. Metode ini cepat, sederhana, murah, dan dapat diandalkan dalam 1 gram / dl untuk diagnosis anemia. Skala warna hemoglobin terdiri dari serangkaian warna tercetak yang sesuai dengan nilai hemoglobin yang berkisar antara 4-14 gram / dl (Gbr. 18.2). Setetes darah ditempatkan pada selembar kertas kromatografi dan warna yang dikembangkan secara visual disesuaikan dengan skala warna yang dicetak. Penelitian menunjukkan bahwa efisiensi lebih dari 90% dalam mendeteksi anemia dan 86% dalam mengklasifikasikan derajatnya. Skala warna hemoglobin telah dikembangkan oleh Organisasi Kesehatan Dunia setelah uji coba lapangan ekstensif. Ini terutama ditujukan untuk deteksi dan pengelolaan anemia di negara-negara yang kekurangan sumber daya. Ini sangat berguna untuk skrining donor darah, untuk skrining anak-anak dan wanita dalam program kesehatan, pemantauan terapi zat besi, pengambilan keputusan terkait rujukan ke rumah sakit, dan sebagai alat POCT.

Metode Cyanmethemoglobin (Hemiglobincyanide)

Ini adalah metode pilihan untuk estimasi hemoglobin dan direkomendasikan oleh Komite Internasional untuk Standardisasi dalam hematologi. Ini karena (i) semua bentuk hemoglobin diubah menjadi sianmetemoglobin (kecuali sulfhemoglobin), dan (ii) standar yang stabil dan dapat diandalkan tersedia.

Prinsip

Darah dicampur dengan larutan kalium ferrisianida, kalium sianida, dan deterjen non-ionik (larutan Drabkin). Eritrosit dilisis menghasilkan larutan hemoglobin yang terdistribusi secara merata. Kalium ferrisianida mengubah hemoglobin menjadi methemoglobin, dan methemoglobin bergabung dengan kalium sianida untuk membentuk sianmetemoglobin (hemiglobincyanida). Semua bentuk hemoglobin yang ada di dalam darah sepenuhnya diubah menjadi satu senyawa, cyanmethemoglobin. Ketika reaksi selesai, absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer pada 540 nm. Pada panjang gelombang ini, cyanmethemoglobin memiliki puncak absorbansi yang luas. Untuk mendapatkan jumlah hemoglobin dalam sampel yang tidak diketahui, absorbansi dibandingkan dengan larutan standar cyanmethemoglobin (konsentrasi hemoglobin diketahui) dengan menggunakan rumus atau grafik / tabel yang telah disiapkan sebelumnya. Reaksi linier hingga 20 gm / dl.

Peralatan

1. Kolorimeter fotolistrik atau spektrofotometer

2. Pipet Sahli ditandai pada 20 μl (20 cmm).

3. Pipet 5 ml.

Reagen

1. Larutan Drabkin (pH 7,0-7,4):

    Kalium ferricyanide 200 mg

    Kalium sianida 50 mg

    Kalium dihidrogen fosfat 140 mg

    Deterjen non ionik 1 ml

    Air suling sampai 1000 ml.

2. Larutan standar sianmetemoglobin dengan nilai hemoglobin yang diketahui.

Spesimen: darah atau darah vena dengan antikoagulan EDTA didapat dari tusukan kulit.

Metode

1. Dalam tabung reaksi, ambil 5 ml larutan Drabkin dan tambahkan 20 μl darah (pengenceran 1: 251). Tutup tabung, campur dengan membalikkan beberapa kali, dan diamkan selama minimal 5 menit. Waktu ini cukup untuk mengubah hemoglobin menjadi cyanmethemoglobin.
2. Pindahkan sampel uji ke kuvet. Baca absorbansi dalam spektrofotometer pada 540 nm atau di kolorimeter fotolistrik menggunakan filter kuning-hijau. Ambil juga absorbansi larutan standar. Absorbansi harus dibaca terhadap blanko reagen (larutan Drabkin).
3. Nilai hemoglobin diperoleh dari rumus yang diberikan di bawah ini atau dari grafik atau tabel yang telah disiapkan sebelumnya.

Hemoglobin in gm/dl = Absorbance of test sample ×

                                        Absorbance of standard

Concentration of standard × Dilution factor

                                                  100

Kurva standar untuk menentukan konsentrasi hemoglobin dengan metode cyanmethemoglobin

Pembuatan grafik dan tabel: Jika dibuat grafik atau tabel yang mengkorelasikan absorbansi dengan konsentrasi hemoglobin, hasil dapat diperoleh dengan cepat. Ini khususnya sesuai jika sejumlah besar sampel diproses secara teratur pada instrumen yang sama.

Standar cyanmethemoglobin encer tersedia secara komersial untuk persiapan grafik kalibrasi. Sebagai alternatif, larutan cyanmethemoglobin standar diencerkan secara serial dengan larutan Drabkin. Pada kertas grafik linier, konsentrasi hemoglobin (sumbu horizontal) di setiap pengenceran diplotkan terhadap absorbansi (sumbu vertikal). Sebuah garis lurus yang menghubungkan titik-titik dan melewati titik awal diperoleh. Dari grafik ini, dapat dibuat tabel yang berkaitan dengan absorbansi dengan konsentrasi hemoglobin (Gbr. 18.3). 

Catatan:

1. Darah lipemik (hipertrigliseridemia), jumlah leukosit total yang tinggi (> 25.000 / μl), atau protein plasma abnormal (misalnya pada mieloma multipel, makroglobulinemia Waldenström) dapat menyebabkan hasil yang salah.
2. Larutan cyanmethemoglobin stabil sehingga keterlambatan pengambilan pembacaan absorbansi tidak mempengaruhi hasil.

Metode Oxyhemoglobin

Dalam metode ini, sampel darah dicampur dengan larutan amonia yang lemah. Absorbansi larutan ini diukur dalam spektrofotometer pada 540 nm atau dalam fotometer menggunakan filter kuning-hijau. Absorbansi sampel uji dibandingkan dengan larutan standar.

Metode ini cepat dan sederhana. Namun, tidak tersedia larutan standar yang stabil, warna larutan oksihemoglobin cepat memudar, dan turunan hemoglobin selain oksihemoglobin tidak diukur.

Metode Berat Jenis

Metode berat jenis adalah metode yang cepat dan sederhana, yang memberikan perkiraan nilai hemoglobin. Biasanya digunakan untuk pemilihan donor darah di bank darah. 

Setetes darah dibiarkan jatuh dalam larutan tembaga sulfat dengan berat jenis 1,053 dari ketinggian 1 cm. Berat jenis 1,053 setara dengan konsentrasi hemoglobin 12,5 gram / dl. Tetesan darah ditutupi dengan proteinat tembaga dan tetap terpisah selama 15-20 detik. Jika tetesan tenggelam dalam waktu ini, berat jenisnya lebih tinggi dari pada larutan tembaga sulfat (yaitu hemoglobin> 12,5 gram / dl) dan kadar hemoglobin dapat diterima untuk sumbangan. Jika mengapung, kadar hemoglobin tidak dapat diterima. Namun, berat jenis whole blood juga dipengaruhi oleh jumlah leukosit total dan konsentrasi protein plasma. Dengan adanya leukositosis (misalnya pada leukemia mieloid kronis) atau hipergammaglobulinemia (misalnya mieloma multipel), nilai hemoglobin akan sangat tinggi. 

KETERANGAN UMUM

• Metode cyanmethemoglobin adalah metode paling akurat untuk memperkirakan hemoglobin.
• Jika dicurigai anemia, sebaiknya mengukur volume sel yang dikemas dan jumlah sel darah merah bersama dengan konsentrasi hemoglobin. Ini akan berguna dalam menilai ketepatan nilai hemoglobin dan dalam perhitungan indeks sel darah merah (untuk klasifikasi morfologi anemia). Volume sel yang dikemas kira-kira tiga kali lipat dari nilai hemoglobin. Aturan ini, bagaimanapun, tidak berlaku untuk anemia hipokromik karena sel darah merah mengandung hemoglobin yang lebih rendah untuk ukurannya.
• Kadar hemoglobin menurun pada anemia, posisi berbaring (5-6%), tekanan berlebihan selama tusukan jari, adanya gumpalan dalam sampel, pencampuran darah yang tidak adekuat dengan antikoagulan, dan anemia “palsu”. Penyebab anemia “palsu” atau “semu” adalah peningkatan volume plasma pada trimester ketiga kehamilan, penumpukan sel darah merah pada splenomegali, retensi cairan pada gagal jantung kongestif, dan peningkatan protein plasma pada paraproteinemia. Kadar hemoglobin meningkat setelah olahraga berat, di dataran tinggi, dalam hemokonsentrasi (misalnya dehidrasi), penggunaan tourniquet yang berkepanjangan selama venepuncture, dan pada polisitemia.
• Pada sebagian besar penganalisis hematologi otomatis, hemoglobin diukur sebagai sianmetemoglobin. 
• Anemia tergolong ringan (nilai hemoglobin dari batas bawah kisaran normal sampai 10,0 gram / dl), sedang (7,0-10,0 gram / dl), dan berat (<7,0 gram / dl).

NILAI RUJUKKAN (ORGANISASI KESEHATAN DUNIA)

• Laki-laki dewasa: 13.0 - 17.0 gm / dl.

• Wanita dewasa (tidak hamil): 12.0 - 15.0 gm / dl.

• Wanita dewasa (hamil): 11.0 - 14.0 gm / dl.

• Anak-anak, 6-12 tahun: 11,5 - 15,5 gm / dl.

• Anak-anak, 6 bulan sampai 6 tahun: 11.0 - 14.0 gm / dl.

• Anak-anak, 2 - 6 bulan: 9,5 - 14,0 gm / dl.

• Saat lahir (cukup bulan): 13,6 - 19,6 gm / dl.

NILAI KRITIS HEMOGLOBIN

• <7 gm / dl (anemia berat)

•> 20 gm / dl (hiperviskositas)

BIBLIOGRAPHY

1. Cheesbrough M. District Laboratory Practice in Tropical Countries. Part 2. Cambridge: Cambridge University Press, 1998.
2. Lewis SM, Bain BJ, Bates I. Dacie and Lewis Practical Hematology (9th Ed). London: Churchill Livingstone, 2001.
3. Wallach J. Interpretation of Diagnostic Tests (7th Ed). Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2000.
4. World Health Organization. Manual of Basic Techniques for a Health Laboratory (2nd Ed). Geneva: World Health Organization, 2003.