Dasar - Dasar Teknik Mikrobiologi

Table of Contents

Pembiakan mikrobia di laboratorium memerlukan media yang berisi zat hara serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi mikroba. Media adalah suatu bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba yang terdiri atas campuran nutrisi atau zat-zat makanan. Selain untuk menumbuhkan mikroba, media dapat juga digunakan untuk isolasi, memperbanyak, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba (Lay, 1994; Jutono dkk, 1980). 

Syarat media yang baik untuk pertumbuhan mikroba adalah lingkungan kehidupannya harus sesuai dengan lingkungan pertumbuhan mikroba tersebut, yaitu : susunan makanannya (media harus mengandung air untuk menjaga kelembaban dan untuk pertukaran zat/metabolisme, juga mengandung sumber karbon, mineral, vitamin dan gas), tekanan osmose yaitu harus isotonik, derajat keasaman/pH umumnya netral tapi ada juga yang alkali, temperatur harus sesuai dan steril. Media harus mengandung semua kebutuhan untuk pertumbuhan mikroba, yaitu: sumber energi (contoh: gula), sumber nitrogen, juga ion inorganik essensial dan kebutuhan yang khusus, seperti vitamin (Jawetz dkk, 1996).

Berdasarkan komposisi kimianya, media dapat dibedakan menjadi media sintetik yaitu media yang susunan kimianya diketahui dengan pasti, medium ini biasanya digunakan untuk mempelajari kebutuhan makanan mikroba. Media non sintetik (kompleks) yaitu media yang susunan kimianya tidak dapat diketahui dengan pasti, media ini digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi mikroba. Berdasarkan konsistensinya media dapat dibedakan menjadi : media cair, media padat, dan media padat yang dapat dicairkan (Lay, 1994; Jutono dkk, 1980; Jawetz dkk, 1996). 

Alat dan bahan:

1. Media Nutrien Agar (NA) (Oxoid)
2. Media Nutrien Broth (NB) (Oxoid)
3. Aquades
4. Cawan petri
5. Tabung reaksi
6. Batang pengaduk, pipet volume, erlenmeyer, penangas/elemen pemanas 

Cara kerja:

1. Timbang media NA (Oxoid) dan NB (Oxoid) sesuai prosedur di kemasan. (Catatan : Buatlah 50 ml media NA untuk setiap kelompok kecil praktikum dan 50 ml media NB untuk satu golongan praktikum). Penimbangan media dilakukan secara teliti dan cepat, kemudian serbuk media dimasukkan secara hati-hati ke dalam erlenmeyer.
2. Tambahkan aquades dan aduk sampai merata dengan batang pengaduk
3. Panaskan dengan hati-hati menggunakan penangas/elemen pemanas sampai media tercampur homogen (ditunjukkan dengan warna yang kuning jernih). Perhatian :pada saat pemanasan jangan sampai terbentuk buih berlebihan sampai meluap!
4. Sebelum diautoklaf, tuangkan media NA dengan volume tertentu menggunakan pipet volume : 5 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA miring, 10 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA tegak, 15 ml untuk NA dalam cawan petri untuk percobaan 4b (metode isolasi pour plate), sisanya untuk NA dalam cawan petri untuk percobaan 6 (pengenalan mikroba di alam). Tutup tabung reaksi denganpenutup tabung (penutupan jangan terlalu rapat!)
5. Sebelum diautoklaf,tuangkan NB ke dalam tabung reaksi untuk 6 kelompok praktikum dalam 1 golongan. Masingmasing tabung reaksi @ 8 ml. Tutup tabung reaksi dengan kapas atau penutup tabung (penutupan jangan terlalu rapat!)
6. Sterilkan seluruh media dalam tabung reaksi tersebut dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit, tekanan 1 atm 121oC. Pelajari cara mengoperasikan autoklaf dengan benar!
7. Setelah diotoklaf : media NA 10 ml dalam tabung reaksi diletakkan tegak pada rak tabung dan biarkan memadat, media NA 5 ml inkubasikan miring dan biarkan memadat. Media sisa NA tuangkan dalam cawan petri dan biarkan memadat (untuk percobaan 6 : pengenalan mikroba di alam). Media NA 15 ml dibiarkan sampai suhu 45-50oC (untuk percobaan 4b : metode isolasi pour plate).
8. Media NB dalam tabung reaksi biarkan dingin. Seluruh media NA dan NB ini akan digunakan untuk percobaan selanjutnya.

Teknik - Teknik Pemindahan Kultur Mikroba

Untuk mencegah tercemarnya biakan murni, perlu diadakan teknik aseptik pada waktu memindahkan mikroba. Dalam percobaanpercobaan ini akan dipelajari cara-cara memindahkan biakan murni dengan cara aseptik. 

Alat dan bahan:

1. Media NA miring dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)
2. Media NA tegak dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)
3. Media nutrien cair atau NB dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)
4. Jarum ose
5. Jarum inokulasi
6. Kultur murni bakteri
7. Lampu bunsen
8. Vortex mixer 

Cara kerja:

1. Siapkan media NA dan NB hasil percobaan 1 (media NA miring, media NA tegak dan media NB/cair). Pemindahan kultur mikroba dilakukan satu persatu untuk masing-masing media. 
2. Longgarkankan tutup dari masing-masing tabung reaksi yang berisi media (jangan di lepaskan!).
3. Pegang tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri di tangan kiri.
4. Pegang jarum ose pada tangan kanan dan bakar di atas nyala lampu bunsen hingga kawat memijar.Perhatian : pemanasan jarum ose dilakukan dari pangkal ke ujung sampai memijar, sebelum digunakan kawat didinginkan beberapa saat!
5. Pegang ose menggunakan ibu jari dan jari telunjuk, gunakan jari kelingking untuk membuka tutup tabung reaksi (tutup tabung reaksi tetap dipegang seperti posisi semula).
6. Bakar mulut tabung reaksi, masukkan jarum ose dan ambil 1 ose biakan bakteri.
7. Bakar kembali mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali.
8. Ambillah tabung reaksi yang akan diinokulasi dengan tangan kiri, dengan cara yang sama buka tutup tabung reaksi, dan bakar mulut tabung reaksi.
9. Inokulasikan biakan bakteri pada tabung reaksi inokulasi dengan cara goresan zigzag pada permukaan NA miring.
10. Bakar mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali, kemudian bakar ose.
11. Beri label : tanggal percobaan, nama bakteri, teknik pemindahan dan nama kelompok.
12. Lakukan dengan cara yang sama untuk media nutrien cair/NB menggunakan jarum ose dan media agar tegak secara tusukan tegak lurus menggunakan jarum inokulasi.
13. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya. 

Teknik-teknik Isolasi atau Penanaman Mikroba

Untuk menanam suatu mikroba perlu diperhatikan faktorfaktor nutrisi serta kebutuhan akan oksigen (gas, O2 atau udara). Cara menumbuhkan mikroba yang anaerob sangat berbeda dengan yang aerob. Mengisolasi suatu mikroba ialah memisahkan mikroba tersebut dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Untuk isolasi harus diketahui cara-cara menanam dan menumbuhkan mikroba pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk pertumbuhannya (Jutono dkk, 1980).

Mikroba jarang terdapat di alam dalam keadaan murni. Kebanyakan merupakan campuran bermacam-macam spesies mikroba. Macam-macam cara mengisolasi dan menanam mikrobia adalah : 

1). Spread plate method (cara tebar/sebar), 

2). Streak platemethod (cara gores),

3). Pour plate method (cara tabur).

Spread Plate Method (Cara Tebar/Sebar)

Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat. 

Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang-kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-300 koloni). Koloni mikrobia yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung. 

Alat dan bahan:

1. Spreader/batang bengkok/batang Drigalsky
2. Pipet volume, lampu bunsen
3. Media NA dalam cawan petri
4. Kultur murni bakteri
5. Larutan pengencer (BPW atau NaCl fisiologis 0,9%)

Cara kerja: 

1. Buatlah pengenceran 10-1– 10-6 dari kultur murni bakteri dengan larutan pengencer.
2. Ambil tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri, buka dan bakar leher tabung.
3. Pindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media NA dalam cawan petri.
4. Bakar spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol, biarkan dingin.
5. Tebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan sampai permukaan agar mengering (lihat Gambar 1).
6. Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara terbalik selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.
7. Bandingkan pertumbuhan dari tiap-tiap pengenceran dan bandingkan pertumbuhannya dengan hasil teknik spread plate pada percobaan 2 (sterilisasi secara filtrasi).

Pour Plate Method (Cara Tabur)

Cara ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 45-50oC dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-koloni yang tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980)

Alat dan bahan:

1. Media NA dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)
2. Cawan petri steril
3. Kultur murni bakteri
4. Pipet volume, lampu bunsen

Cara kerja:

1. Dinginkan media NA dalam tabung reaksi sampai suhu ± 45 - 500C (cirinya : terasa hangat di kulit/tidak ‘kemranyas’).
2. Buka tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri, dan bakar leher botol.
3. Pindahkan 1 ml kultur murni bakteri ke dalam tabung reaksi yang mengandung NA secara aseptis.
4. Bakar leher tabung di atas bunsen, dan tuangkan media NA yang telah mengandung kultur murni bakteri ke dalam cawan petri.
5. Goyangkan perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan NA sampai homogen.Penggoyangan petri jangan terlalu kuat. Pada saat penuangan media, petri bisa diletakkan dalam radius maksimal 20 cm dari sumber api (zona steril) (lihat Gambar 2).
6. Setelah agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 24 jam. Inkubasi terbalik dilakukan setelah agar memadat. Amati pertumbuhannya.

Streak Plate Method (Cara Gores)

Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada cawan agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Cara ini dasarnya ialah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980). Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri yang memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunakan lempengan yang basah. Untuk mencegah hal itu harus digunakan lempengan agar yang benar-benar kering permukaannya (Lay, 1994)

Alat dan bahan:

1. Media NA dalam cawan petri
2. Kultur murni bakteri
3. Jarum ose
4. Lampu bunsen

Cara kerja:

1. Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian dinginkan. Gunakan ose yang telah dingin untuk menggores pada permukaan media agar dalam cawan petri.
2. Ambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan pada permukaan media agar dimulai pada satu ujung. Perhatikan teknik penggoresan! (lihat Gambar 3, 4, 5, 6). Ose disentuhkan pada permukaan media agar dalam cawan petri, sewaktu menggores ose dibiarkan meluncur di atas permukaan agar.
3. Setiap kali menggoreskan ose untuk kuadran berikutnya, pijarkan ose terlebih dahulu dan biarkan dingin.
4. Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan amati pertumbuhannya. 

Pembuatan Pulasan Bakteri

Bakteri atau mikroba lainnya dapat dilihat dengan mikroskop cahaya tanpa pewarnaan/pengecatan atau dengan pewarnaan/pengecatan. Pengamatan tanpa pengecatan lebih sukar dan tidak dapat dipakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti karena sel bakteri atau mikroba lainnya transparan atau semi transparan.Dengan pengecatan, dapat dilihat struktur sel mikroba lebih seksama. 

Fungsi pengecatan adalah 

a). memberi warna pada sel atau bagian-bagiannya sehingga member kontras dan tampak lebih jelas, 

b). dapat untuk menunjukkan bagian-bagian struktur sel, 

c). membedakan mikroba satu dengan yang lain,dan 

d). menentukan pH dan potensial oksidasi reduksi ekstraseluler dan intraseluler (Jutono dkk., 1980).

Pengecatan bakteri umumnya menggunakan lebih dari satu tingkat pengecatan. Hasil pengecatan dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti : fiksasi, substrat, dekolorisator dan sebagainya. Dalam pembuatan pulasan bakteri yang siap diwarnai, perlu dilakukan fiksasi terlebih dahulu yang bertujuan antara lain : 

a). mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel, 

b). merubah afnitas cat,

c). mencegah terjadinya otolisis sel, 

d). dapat membunuh mikroba secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya, 

e). melekatkan bakteri di atas gelas benda dan, 

f). membuat sel-sel lebih kuat/keras.

Cara fiksasi yang paling banyak digunakan dalam pengecatan bakteri adalah dengan membuat lapisan suspensi/pulasan bakteri di atas gelas benda, kemudian dikeringanginkan dan dilalukan beberapa kali di atas nyala lampu spiritus (Jutono dkk., 1980). 

Alat dan bahan :

1. Gelas benda
2. Jarum ose
3. Lampu Bunsen
4. Label preparat
5. Aquades steril
6. Kultur murni bakteri
7. Penjepit gelas benda

Cara kerja :

1. Labellah gelas benda yang kering dan bersih. Sterilkan jarum ose dengan memijarkannya pada nyala bunsen dan dinginkan.
2. Jika kultur dalam bentuk cair (suspensi), ambillah 1 ose penuh dan letakkan di tengah-tengah gelas benda dan ratakan seluas ± 1 cm2.
3. Jika kultur dalam medium padat, ambillah dengan jarum ose satu bagian kecil kultur dan letakkan di tengah gelas benda yang sebelumnya telah diberi aquadest steril dan ratakan
4. Biarkan kering dengan mengangin-anginkan gelas benda
5. Fiksasi pulasan bakteri dengan melewatkan di atas nyala bunsen (hati-hati, jangan sampai terlalu kering/gosong), tergantung jenis pengecatannya.
6. Pulasan bakteri siap untuk diwarnai.

Sumber : Anonim. 2016. Panduan Praktikum Mikrobiologi . Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Baca juga :

1. Contoh SPO Pemeriksaan BTA Di Puskesmas 
2. Patogenesis Mycobacterium Tuberculosis Dan Penentu Molekuler Virulensi
3. Mengenal Biosafety Cabinet
4. Perbedaan Rapid Test Antibodi, Rapid Rest Antigen Dan Swab PCR
5. Prinsip Pewarnaan GRAM