Praktikum Isolasi DNA Kromosom dan Plasmid

Table of Contents

DNA merupakan pembawa materi genetik bagi hampir semua makhluk hidup yang ekspresinya dipengaruhi oleh lingkungan internal atau eksternal seperti perkembangan fisik atau perilaku organisme itu sendiri. Molekul DNA membawa informasi hereditas dari sel dan komponen protein (molekul-molekul histon) dari kromosom. Menurut Nicholl (1994) DNA merupakan polinukleotida (polimer nukleotida) yang terdiri atas tiga komponen diantaranya gula deoksiribosa, gugus fosfat dan basa nitrogen, untai berbentuk “double helix” dan antar nukleotidanya dihubungkan oleh ikatan 5’-3’ fosfodiester.

Dalam analisa biologi molekuler, tahap awal dan essensial yang harus dilakukan yaitu isolasi DNA. Menurut Surzycky (2000) isolasi DNA dengan berat molekul yang tinggi menjadi sangat penting seiring dengan meningkatnya permintaan di bidang DNA fingerprinting, RFLP, konstruksi genom atau sequencing libraries dan analisa PCR dalam laboratorium penelitian maupun industri. Isolasi DNA dapat dilakukan dari tanaman, hewan maupun bagian tubuh manusia. Isolasi DNA dilakukan dengan merusak dinding sel dan membran inti, kemudian dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain, selanjutnya dipisahkan dari kontaminan lain seperti RNA maupun protein. 

Isolasi DNA yang dilakukan pada praktikum ini yaitu dari sel bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis. Penggunaan kedua jenis isolat tersebut didasarkan atas perbedaan Gram. Escherichia coli merupakan bakteri Gram (-) sedangkan Bacillus subtilis merupakan Gram (+). Kedua jenis isolat ini akan dibandingkan kemurnian DNA dan visualisasinya dengan uji kuantitatif dan kualitatif. Uji kualitatif dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa, sedangkan uji kuantitatif dengan spektrofotometer UV-Vis. Nilai kemurnian DNA yang tinggi (range antara 1,8-1,9) merupakan salah satu acuan untuk tahap teknik biologi molekuler berikutnya. 

DNA Plasmid

DNA plasmid memiliki karakteristik kecil, sirkuler / melingkar, DNA ekstrakromosom pada beberapa bakteri. Secara alamiah, plasmid berukuran cukup besar yakni sekitar kurang dari 1.000 bp sampai lebih dari 200 kbp. Akan tetapi plasmid yang sering digunakan untuk teknik rekayasa genetika yaitu berkisar antara 4-5 kbp. Apabila dibandingkan dengan ukuran DNA kromosom Escherichia coli yaitu sebesar 4000 kbp, ukuran plasmid jauh lebih kecil. Karakteristik lain dari plasmid yaitu mengandung gen resisten terhadap antibiotik, dimana pada bakteri normal, gen ini tidak tersedia. DNA plasmid di dalam bakteri memiliki konfigurasi supercoiled / terpilin seperti pita karet. Ketika diisolasi, konfigurasi DNA plasmid dapat berbentuk supercoiled atau berubah menjadi relaxed (ketika mengalami katalisis oleh enzim DNAse pada salah satu bagiannnya) atau dapat juga berbentuk linier. 

Melalui proses transfer plasmid, bakteri akan memperoleh karakteristik baru. Beberapa ahli rekayasa genetika telah mengembangkan penggunaan enzim restriksi untuk memotong dan menyambung gen ke dalam plasmid. Plasmid tersebut kemudian dipindahkan ke dalam sel bakteri atau inang. Selanjutnya bakteri akan menggunakan gen hasil rekombinasi untuk menghasilkan protein. Ketersediaan jumlah DNA plasmid dalam jumlah besar memiliki beberpa peranan, diantaranya pembuatan probe DNA, penentuan urutan DNA, membuat gen termutasi.

Prosedur yang sering digunakan dalam isolasi DNA bakteri sangat banyak dan bervariasi. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk mengisolasi DNA plasmid yaitu metode “Minipreps / Alkaline Lysis”. Proses isolasi dilakukan untuk jumlah kultur setara dengan 1,5 ml. Metode ini biasanya dilakukan sebagai penelitian pendahuluan dalam mendeteksi keberadaan plasmid pada bakteri atau mengetahui fragmen DNA plasmid yang diinginkan. 

Kegiatan Praktikum Isolasi DNA Kromosom dan Plasmid

1. Bahan Praktikum

    a. Isolasi Genomik DNA Bakteri

• Kultur mikroorganisme : Lactobacillus plantarum dan Escherichia coli
• LB (Pepton 1%, ekstrak khamir 0,5%, NaCl 1%) b/v
• TE buffer (10 mM tris-Cl pH 8, 1 mM EDTA)
• Lisozim konsentrasi 20 mg/mL dalam TE buffer
• Proteinase-K konsentrasi 1 mg/mL dalam larutan STEP
• Tris buffer fenol
• Na-asetat 3 M
• Etanol 100%
• Kloroform : isoamil alkohol (24 : 1) 
• Etanol 70% 
• RNAse
• ddH2O steril 
• Agarosa
• Etidium bromida
• Loading buffer
• Kapas
• Kertas payung
• Akuades
• Spirtus
• Karet
• Es batu

   b. Isolasi DNA Plasmid

• Kultur Escherichia coli rekombinan
• LB (Pepton 1%, ekstrak khamir 0,5%, NaCl 1%) b/v
• Ampisilin 100 mg / mL
• Solution I steril (glukosa 50 mM, EDTA 10 mM, tris-HCl 25 mM pH 8)
• Solution II steril (NaOH 0,2 M, SDS 1% dibuat saat eksperimen) 
• Solution III steril (potasium asetat 5 M 60 mL, asam asetat glasial 11,5 mL, air 28,5 mL) 
• Isopropanol
• Etanol 70% ke dalam tube eppendorf. 
• RNAse 1 mg/mL dalam Tris-HCl 10 mM pH 8)
• 20% PEG/2,5 M NaCl
• Etanol 70%.
• Tris Cl 10 mM pH 8
• Kapas
• Kertas payung
• Alkohol 70%
• Akuades
• Spirtus
• Karet
• Plastik
• Es batu

2. Peralatan Praktikum

    a. Isolasi Genomik DNA Bakteri

• Waterbath shaker
• Sentrifuse dingin 
• Freezer -20oC
• Falcon tube
• Sentrifuse dingin
• Ice box
• Mikropipet
• Seperangkat alat elektroforesis DNA
• Konsentrator
• Inkubator
• Spektrofotometer
• Kamera polaroid 
• UV Iluminator

   b. Isolasi DNA Plasmid

• Shaker inkubator
• Sentrifuse dingin 
• Freezer -20oC
• Microtube for centrifuge
• Ice box
• Termomixer 
• Mikropipet
• Seperangkat alat elektroforesis DNA
• Konsentrator
• Spektrofotometer
• Kamera polaroid 
• UV Iluminator
• Vorteks
• Glassware (tabung reaksi, petridish, erlenmeyer)
• Autoklaf
• Loop / Ose
• Bunsen
• Botol semprot
• Korek api

3. Prosedur Kerja Praktikum Isolasi DNA Kromosom dan Plasmid

   Prosedur Isolasi Genomik DNA Bakteri (Modifikasi Ashmaig, Hasan, El Gaali, 2009)

• sebanyak 1 koloni tunggal dari lempeng agar diinokulasi ke dalam 10 ml medium LB cair steril (Pepton 1%, ekstrak khamir 0,5%, NaCl 1%) b/v, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 16-18 jam untuk E. coli  dan pada 10 ml medium MRSB steril, lalu diinkubasi suhu 30oC dengan selama 24 jam untuk L. Plantarum.
• kultur bakteri disentrifuse pada kecepatan 6000 rpm suhu 4oC selama 5 menit, lalu supernatan dibuang.
• pelet dicuci menggunakan 2 mL TE buffer (10 mM tris-Cl pH 8, 1 mM EDTA) sebanyak 2 kali.
• Sebanyak 200 µl lisozim konsentrasi 20 mg/mL dalam TE buffer ditambahkan pada pelet pada suhu ruang selama 3 jam dan dibolak-balik. 
• sebanyak 200 µl Proteinase-K konsentrasi 1 mg/mL dalam larutan STEP ditambahkan ke dalam suspensi pelet, diinkubasi pada waterbath suhu 65oC selama 1 jam dibolak balik perlahan setiap 3-5 menit.
• Sebanyak 300 µl TE buffer ditambahkan dan didiamkam 10 menit agar suspensi mencapai suhu ruang, kemudian letakkan pada es.
• sebanyak 750 µl tris buffer fenol ditambahkan, dicampur selama 5 menit dengan cara dibolak-balik perlahan (jangan divorteks). 
• kemudian disentrifuse pada suhu 4oC kecepatan 6000 rpm selama 5 menit (DNA berada pada supernatan fase atas).
• Fase atas dengan tip steril yang ujungnya telah dipotong (jangan sampai terambil bagian tengah atau fase intermediet), kemudian di transfer ke falcon tube baru.
• apabila fase tengah terambil, tahap penambahan tris buffer fenol dan sentrifuse diulang.
• tambahkan kloroform : isoamilalkohol 24 : 1 sebanyak 1 kali dari volume sampel ke dalam tube, dibolak balik perlahan (jangan divortex) kemudian dilakukan sentrifugasi 6000 rpm selama 5 menit, di ambil fase atas dan transfer pada falcon tube baru (jangan sampai fase tengah terambil). Lakukan sebanyak 2 kali.
• tambahkan  5 µl RNAse kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit.
• tambahkan Na-asetat 3 M sebanyak 0,1 kali dari volume sampel ke dalam tube dan ice cold etanol absolut sebanyak 2,5x volume tahap sebelumnya, lalu bolak-balik tube secara perlahan (DNA dan RNA akan mengendap membentuk globula).
• Dilakukan inkubasi pada -20°C selama 1 jam.
• disentrifuse 10.000 rpm selama 15 menit untuk mengendapkan DNA, supernatan dibuang.
• Dicuci menggunakan 1 ml ice cold etanol 70% kemudian disentrifugasi menggunakan 10.000 rpm selama 15 menit, supernatan dibuang. Lakukan sebanyak 2 kali.
• pelet DNA dikeringkan pada konsentrator suhu 37-45oC sampai alkohol menguap dan tidak berbau.
• pelet DNA dilarutkan dalam 50 µL ddH2O steril hangat.
• larutan DNA disimpan di suhu -20oC.
• sebanyak 4 µL DNA dicek dengan elektroforesis gel agarosa, kemudian dianalisa konsentrasi dan kemurnian DNA secara spektrofotometrik.

 

Ekstraksi Plasmid Skala Kecil (Mini Preparation) dengan Metode Alkali (Sambrook and Russel Modifikasi, 2001)

• sebanyak 1 koloni tunggal E.coli rekombinan dari lempeng agar diambil dan dibiakkan pada medium LB steril + ampisilin (100µg/mL) pada suhu 37oC selama 16-18 jam. Perhatian : Larutan ampisilin stok 100 mg/mL.
• sebanyak 1,5 mL kultur E.coli rekombinan dimasukkan pada tube eppendorf 1,5 mL.
• disentrifuse 6000 rpm 4oC selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet bakteri dibiarkan tetap dalam tube eppendorf.
• sebanyak 100 µL solution I steril (glukosa 50 mM, EDTA 10 mM, tris-HCl 25 mM pH 8) ditambahkan ke dalam tube eppendorf, divorteks sampai seluruh pelet tercampur sempurna, lalu dibiarkan dalam suhu ruang selama 5 menit.
• sebanyak 200 µL solution II steril (NaOH 0,2 M, SDS 1% dibuat saat eksperimen) ditambahkan ke dalam tube eppendorf  dan dikocok dengan cara dibolak-balik perlahan, lalu diinkubasi di es selama tepat 5 menit (inkubasi terlalu lama akan menyebabkan meningkatnya kontaminasi genom).
• suspensi akan menjadi bening, dan pada tutup tube akan nampak benang-benang yang lengket.
• sebanyak 150 µL solution III steril (potasium asetat 5 M 60 mL, asam asetat glasial 11,5 mL, air 28,5 mL) ditambahkan ke dalam tube dikocok dengan cepat dan kuat, kemudian diinkubasi di es selama 5 menit.
• disentrifuse 13000 rpm, 4oC selama 20 menit. Lalu supernatan (kira-kira 400 µL) diambil hati-hati (jangan sampai endapan terbawa), dipindahkan ke tube baru.
• sebanyak 300 µL isopropanol ditambahkan ke dalam tube tersebut, kemudian tube ependorf dibolak balik.
• didiamkan pada suhu ruang selama 30 menit.
• disentrifuse 13000 rpm, suhu 4oC selama 30 menit, supernatan dibuang.
• pelet DNA dicuci dengan menambahkan 0,5 mL ice cold etanol 70% ke dalam tube eppendorf. Lakukan 2 kali.
• disentrifuse 13000 rpm 4oC selama 5 menit supernatan dibuang.
• tube tersebut dikeringkan dengan konsentrator suhu 45oC selama 10-15 menit.
• DNA (pelet) hasil miniprep dilarutkan dengan 50 µL (RNAse 1 mg/mL dalam Tris-HCl 10 mM pH 8), diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. DNA miniprep kemudian disimpan pada -20oC hingga digunakan pada tahapan percobaan berikutnya.

Penentuan Konsentrasi dan Kemurnian DNA dengan Spektrofotometer (Sambrook and Russell, 2001 modifikasi)

• 500 µL larutan sampel DNA yang telah diencerkan dimasukkan ke dalam kuvet (5µL DNA ditambah dengan 495µL ddH2O), blanko yaitu 500 µL ddH2O.
• diukur serapan DNA dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
• konsentrasi DNA dihitung dengan rumus : A 260 x FP x 50 g/mL. Nilai A260 = 1 menunjukkan konsentrasi DNA untai ganda sebesar 50g/mL.
• Kemurnian DNA dihitung dengan rumus : A 260 / A 280

Tujuan Praktikum Isolasi DNA Kromosom dan Plasmid

Praktikum ini bertujuan untuk:

1. Mengisolasi DNA kromosom.

2. Mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA kromosom hasil isolasi.

Indikator Belajar Praktikum Isolasi DNA Kromosom dan Plasmid

Setelah menyelesaikan praktikum ini, mahasiswa diharapkan mampu:

1. Mengaplikasikan teknik isolasi DNA kromosom.

2. Mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA kromosom dan plasmid hasil isolasi.

Sumber : Kusnadi, J. dkk. (2017). Isolasi DNA Kromosom dan Plasmid ; Modul Praktikum Rekayasa Genetika. Univeristas Brawijaya : Malang. 

Baca juga :