Praktikum Pewarnaan Gram

Table of Contents

 Judul praktikum : Pewarnaan Gram

Tujuan :  mengamati bentuk dan warna bakteri menggunakan pewarnaan gram 

Prinsip pemeriksaan : bakteri pada objek glass diberi zat warna kristal violet, iodium, alkohol dan safranin, kemudian dilihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 100 X 

Dasar Teori  Praktikum Pewarnaan Gram

Pewarnaan secara gram adalah pewarnaan yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi dan klasifikasi bakteri, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.

Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya, maka pewarnaan ini juga disebut pewarnaan diferensial.

Mikroorganisme terutama bakteri sulit dilihat dengan menggunakan mikroskop cahaya, karena tidak mengasorbsi ataupun membiaskan cahaya.

Tehnik pewarnaan merupakan cara yang banyak dipergunakan untuk melihat struktur dan morfologi bakteri. Terdapat beberapa tehnik pewarnaan diantaranya, pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu macam larutan warna contohnya pewarnaan sederhana dan pewarnaan negative, kemudian pewarnaan diferensial, merupakan pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu macam larutan warna, contohnya pewarnaan gram, pewarnaan tahan asam, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan spora.

Sebelum melakukan prosedur pewarnaan terhadap bakteri, terdapat beberapa hal yang perlu diperhatikan, seperti gelas objek dibersihkan dengan menggunakan alcohol 70% untuk menghilangkan debu atau lemak, kemudian pewarnaan diferensial terlebih dahulu dibuat preparat, dan fiksasi dapat dilakukan dengan melewatkan preparat ulas diatas nyala api, adapun tujuan dilakukan fiksasi antara lain untuk melekatkan sel bakteri pada objek glass, mematikan sel bakteri dan lain sebagainya.

Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel tipis. Bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada diantara dua lapis membrane sel. Contohnya bakteri gram positif yaitu Bacillus subtilis dan gram negative Contohnya : Eschenchia coli (UNSOED,2008). 

Perbedaan gram positif dan negative menurut Hadioetomo (1985), yaitu : 

• Gram positif adalah organism yang dapat menahan komplek pewarna primer ungu Kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel tampak biru gelap atau ungu ). 
• Gram negatif adalah organism yang kehilangan komplek warna ungu Kristal pada waktu pembilasan dengan alcohol namun kemudian terwarnai oleh pewarnaan tandingan safranain (sel tampak merah muda). 

Adanya lugol’s iodine menyebabkan adanya ikatan CV dengan iodine yang akan meningkatkan afinitas penigkatan zat warna oleh bakteri. Pada gram positif dapat terbentuk CV iodine ribonukleat pada dinding sel. Penekson etanol absolut menyebabkan terbentuknya pori-pori pada gram negatif yang memiliki banyak lapisan lemak (lipid larut dalam etanol), sehingga komplek CV iodine tetap menempel di diding sel, sel gram negatif menjadi bening. Safranin akan mewarnai sel gram negatif menjadi merah, sedangkan gram positif tidak berpengaruh. Counterstrain hanya berfungsi sebagai pengontras saja.

sel-sel bakteri yang bersifat gram positif adalah bakteri yang mengikat zat warna dasar (utama) dengan kuat sehingga dapat dilunturkan oleh zat peluntur dan tidak dapat diwarnai lagi oleh zat lawan. Pada pengamatan mikroskopik, sel-sel bakteri gram positif berwarna biru ungu (violet).Bakteri gram negatif adalah bakteri yang daya pengikat zat warna dasarnya tidak kuat, sehingga dapat dilunturkan dan dapat diwarnai kembali oleh zat warna lawan. Pada pengamatan mikroskopik sel-sel bakteri pada pewarnaan gram ini tampaknya berwarna merah .

Alat dan Bahan Pewarnaan Gram

 Alat :

• ose
• Bunsen
• Objek glass
• Deck glass
• Mikroskop
• Pipet tetes
• Rak pewarnaan

 Bahan : 

• biakan bakteri staphylococcus, streptobacil,enterobacter
• NaCl Fisisologis
• Cat Gram A ( Gentian violet) 

  - kristal Violet         2 gram

  - alokoh 95 % 20 ml

  - Amonium oksalat 0,8 gram

  - aquadest         80 ml

• Cat Gram B (Lugol)

  - Iodium        1 gram 

  - Kalium Iodide        2 gram

• Aquadest              300 ml
• Cat Gram C (bahan pelarut)

          - Aceton         50 ml

  - Alkohol 95% 50 ml

• Cat Gram D

  - Safranin        0,25 gram

  - alkohol 95% 10 ml

  - aquadest 95 ml

Cara kerja Pewarnaan Gram

1. Ambil objek glass yang bersih dan bebas lemak
2. Beri setetes aquadest diatas objek glass
3. Ambil biakan kuman dengan menggunakan ose bulat yang telah disterilkan diatas api bunsen
4. Campur biakan kuman dengan aquadest yang ada diatas objek glass dengan menggunakan ose bulat tersebut.
5. Fiksasi objek glass yang berisi biakan kuman dengan cara melewtkan objek glass diatas api bunsen hingga kering.
6. Teteskan cat Gram A hingga menutupi permukaan bakteri.
7. Diamkan selama 1 menit.
8. Bilas dengan aquadest.
9. Teteskan cat Gram B hingga menutupi permuaan bakteri kemudian diamkan selama 1-2 menit.
10. Bilas dengan aquadest.
11. Teteskan cat Gram C, diamkan selama 30 detik.
12. Bilas dengan aquadest.
13. Teteskan cat Gram D, diamkan selama 1 menit kemudian bilas dengan aquadest.
14. Keringkan dengan menggunakan tissue kering.
15. Diamati dibawah mikroskop pembesaraan 100 X dengan minyak imersi.

Hasil pengamatan : bentuk bakteri, warna bakteri, susunan bakteri, Gram positif/Negatif

A. Makroskopis :  

Sampel 1 

     Kode sampel (+)

     Warna : orange 

      Bentuk : cair (suspensi)

     Bau : - 

Sampel 2

     Kode sampel (-)

     Warna : jingga

     Bentuk : cair (suspensi)

     Bau : - 

B. Mikroskopis :

     Sampel 1

     

Hasil pengamatan mikroskopis pada sampel 1

     Bentuk bakteri : coccus (bulat), bergerombol

     Warna bakteri : ungu

     Termasuk bakteri gram positif (+)

    Sampel 2

    

Hasil pengamatan mikroskopis sampel 2

    Bentuk bakteri : basil (batang), tidak berkoloni

    Warna bakteri : merah

    Termasuk bakteri gram negative (-)

Pembahasan Praktikum Pewarnaan Gram

a. Pada saat praktikum, sampel yang sudah dalam bentuk cair (suspensi) langsung difiksasi diatas api bunsen tanpa perlu dicampur dengan NaCl. Jika sampel dalam bentuk koloni (biakan) maka perlu di gerus satu koloni dan ditambahkan NaCl ataupun aguade. Penambahan NaCl lebih dianjurkan disbanding aquades karena NaCl lebih dapat melekatkan zat warna di banding aquades

b. Sampel 1 menyerap zat warna utama (gentian violet) sehingga dapat dipastikan sampel 1 merupakan bakteri gram positif, sedangkan sampel 2 tidak menyerap zat warna utama namun menyerap zat warna pembanding sehingga dapat dipastikan sampel 2 merupakan Bakteri Gram Negatif.

c. Saat praktikum didapat beberapa kendala, diantaranya : 

• Proses fiksasi yang terlalu lama sehingga sampel 1 saat dicuci bakterinya ikut tercuci sehingga pada saat pengamatn hanya dilihat beberapa bakteri
• Cara pengolesan yang tidak baik menyebabkan koloni bakteri terpencar sehingga pada saat pengamatan ada bakteri yang berdempetan (diplokokus dan tetrakokus) dan ada yang tunggal
• Proses pembilasan yang tidak bersih menyebabkan masih ada zat warna yang melekat, sehingga pada saat pengamatan, dilihat 2 zat warna dibawah mikroskop

Kesimpulan Praktikum Pewarnaan Gram

Dari hasi pengamatan dilaboratorium, didapat :

Sampel 1 : bakteri gram positif berbentuk kokus bergerombol (staphylococcus) berwarna ungu karena menyerap zat warna utama ( gentian violet )

Sampel 2 : bakteri Gram negatif, berbentuk basil (monobasil) berwarna merah karena menyerap zat warna pembanding ( safranin) 

Sumber : Yohana D.B. hurint. 2015. laporan Akhir Praktikum Bakteriologi I. Poltekkes Kemenkes Kupang

PENTING : Terimakasih sudah berkunjung ke website infolabmed.com. Jika Anda mengutip dan atau mengambil keseluruhan artikel dalam websit ini, mohon untuk selalu mencantumkan sumber pada tulisan / artikel yang telah Anda buat. Kerjasama/media partner : laboratorium.medik@gmail.com.

Baca juga :

1. Pemeriksaan Bakteri Metode Tetesan Tegak
2. Pemeriksaan Bakteri Cara Preparat Tetes Bergantung (Hanging Drop)
3. Cara Isolasi Mikroorganisme
4. Cara Membuat Media Pertumbuhan Nutrient Agar Dan Potato Dextrose Agar
5. Dasar - Dasar Teknik Mikrobiologi
6. Contoh SPO Pemeriksaan BTA Di Puskesmas 
7. Patogenesis Mycobacterium Tuberculosis Dan Penentu Molekuler Virulensi
8. Mengenal Biosafety Cabinet
9. Perbedaan Rapid Test Antibodi, Rapid Rest Antigen Dan Swab PCR