Fiksasi Sediaan Histologi

Table of Contents

(Image : https://docplayer.com)

A. FIKSASI SEDIAAN HISTOLOGIK

Seperti yang Anda telah ketahui, bahwa spesimen yang masuk ke dalam laboratorium Patologi Anatomi pada umumnya terbagi menjadi dua yaitu spesimen jaringan dan spesimen sel . Dalam sub topik ini, pembahasan hanya berkisar tentang fiksasi jaringan. Pada dasarnya materi di sub topik sebelumnya hampir seluruhnya mendukung tentang fiksasi jaringan. 

Adapun prosedur untuk fiksasi jaringan adalah sebagai berikut : 

• Potong spesimen jaringan / organ dengan ukuran kurang lebih 4 mm 
• Rendam dengan larutan fiksasi sesuai dengan tujuan pewarnaan atau komponen target
• Tunggu hingga tahap fiksasi selesai sempurna 
• Cuci dengan air mengalir atau aquades ( jika diperlukan ) 
• Lakukan tahap selanjutnya

Mengingat target dari jaringan berbeda - beda seperti jenis sel yang ditemukan atau komponen lainnya ( kimiawi atau imunologi ) maka berikut ini akan dibahas tentang jenis - jenis larutan fiksasi untuk jaringan. 

1. Formalin 

Formalin merupakan nama dagang dari suatu larutan yang mengandung 40% b/v (= 40% b/b) formaldehida (yang merupakan gas) di dalam air. Sebagian besar formaldehida hadir sebagai polimer larut, yang dipolimerisasi pada suatu larutan. Formalin mengandung sekitar 10% metanol, yang ditambahkan oleh produsen untuk menghambat pembentukan polimer yang lebih tinggi, yang menghasilkan suatu larutan yang biasa disebut dengan paraformaldehida. Ketika penyimpanan formalin di tempat yang dingin, maka akan terdapat endapan bubuk putih. Formaldehid dalam larutan dapat melakukan reaksi dengan sendirinya (reaksi cannizzaro) dan berubah menjadi metanol dan asam formiat. Monomer formaldehida hampir seluruhnya mengandung metilen hidrat, senyawa lain yang dibentuk akibat reaksi yang reversibel dengan air. Formaldehida itu sendiri adalah senyawa yang bereaksi dengan protein dan ada pada konsentrasi yang sangat rendah yaitu 4% formaldehida dalam larutan. Struktur kimia formaldehida terlihat dalam Gambar x.

(Gambar : Sediian histologi yang di fiksasi dengan larutan Formalin) 
https://ikons.id

Larutan fiksatif yang paling umum digunakan untuk histopatologi adalah larutan 4% formaldehid yang biasa disebut dengan formalin 10%. Penggunaan larutan ini telah 50 tahun digunakan, hal ini dikarenakan larutan fiksatif dapat mempertahankan ph netral dan memiliki tekanan osmotik yang sama dengan cairan ekstraseluler. Untuk memastikan bahwa penggunaan formalin mencapai pH yang netral maka dilakukan dengan menambah garam sehingga disebut dengan netral buffered formalin, atau NBF. Larutan NBF melakukan kerjanya sebagai agen fiksasi bukan dengan koagulasi, tetapi dengan menambahkan ke sisi - rantai dasar asam amino, terutama lisin, dan ikatan peptida dari atom amida nitrogen. Ikatan silang menghubungkan metilen terbentuk dari dua sisi formaldehida yang saling mengikat bersama sama. Dengan ikatan ini, maka NBF dapat menurunkan permeabilitas untuk makromolekul tetapi struktur molekul protein begitu berubah. Dengan ukuran yang kecil dari molekul metilen glikol dan formaldehida memungkinkan penetrasi menjadi cepat, dan dengan akibatnya fiksatif ini cocok untuk spesimen dengan ukuran yang besar atau kecil. Sayangnya, meskipun penetrasi menggunakan formalin memiliki penetrasi yang cepat pada jaringan, reaksi antara formaldehida dengan protein jaringanuntuk menjadi ikatan metilen tetap terjadi secara perlahan - lahan. Inilah kesalahan yang sering terjadi biasa ketika menggunakan formalin sebagai larutan fiksasi. Untuk ukuran jaringan yang kecil (10 × 10 × 3mm) ketika difiksasi menggunakan NBF selama 12-24 jam pada umumnya akan menunjukkan kondisi sitoplasma dan inti yang baik dan rinci. Penggunaan formaldehida sebagian besar akan sempurna terfiksasi dalam waktu 24 jam, tetapi reaksi silang ini akan terus berlanjut selama hingga kurang lebih dua minggu. 

Untuk spesimen yang lunak seperti otak manusia secara keseluruhan membutuhkan waktu 2-6 minggu ketika difiksasi di NBF hingga menjadi cukupkuat untuk dipotong - potong. Dengan adanya variasi waktu dan kondisi fiksasi maka akan menyebabkan sebagian besar masalah di sediaan ketika dilakukan pewarnaan histokimia. Fiksasi sangat mempengaruhi hasil suatu pewarnaan sediaan histologik dan imunohistokimia. Seorang teknisi patlogi anatomi, patolog maupun peneliti harus dapat memutuskan metode yang paling tepat dalam hal fiksasi ini. Aspek yang perlu dipertimbangkan adalah suhu, ukuran wadah penyimpanan, rasio volume, konsentrasi garam buffer, ph dan waktu inkubasi. Fiksasi formalin biasanya dilakukan pada suhu kamar, menggunakan wadah spesimen rendah dan lebar untuk memungkinkan penetrasi yang optimal dan kemudahan dalam pengambilan spesimen oleh teknisi. Pilihan terbaik untuk rasio volume adalah 1:20, dan dimensi jaringan sebesar 3-4 mm. Untuk mencegah pembengkakan atau menyusut dari sel - sel maka larutan dibuat isotonik dengan ph 7,2-7,4 dianjurkan, dan juga untuk mempertahankan ultrastruktur sel serta meminimalkan distorsi sel. Semakin pendek waktu jeda pengambilan jaringan dari tubuh terhadap waktu perendaman dalam larutan fiksatif membuat hasil semakin baik. Waktu paparan fiksatifpun harus dioptimalkan untuk setiap jenis spesimen. Sebagai contoh, target dari glikogen di hati dapat dijadikan subjek dari artefak fiksasi. NBF akan menembus secara perlahan melalui membran hepatosit, dengan waktu penetrasi pada sel hepatosit ini glikogen yang berhubungan dengan matriks protein sitoplasma akan terpindahkan ke satu sisi dari sel. Hasil ini disebut sebagai polarisasi dan dianggap bagian dari morfologi ketika membedakan hasil dari pewarnaan.

2 . Larutan Bouin 

Pol André Bouin (1870-1962) menemukan beberapa campuran fiksatif di tahun - tahun 1895-1900. Larutan fiksasi yang paling sering dikaitkan dengan namanya adalah larutan Bouin yang pertama kali dilaporkan pada tahun 1897. Larutan Bouin sendiri berisi 10% formaldehida (25 % formalin), asam asetat 0.9 M dan 0.04 M asam pikrat yang dilarutkan di dalam air. Asam pikrat menembus jaringan agak lambat, mengentalkan protein dan dapat menyebabkan beberapa penyusutan. Selain penggunaan asam pikrat akan menyebabkan jaringan menjadi berwarna kuning. Larutan Bouin ini memiliki pH berkisar 1,5 - 2. Penetrasi menggunakan larutan Bouin imi lebih cepat daripada penggunaan NBF. Efek komplementer dari ketiga komponen penyusun larutan Bouin ini bekerja baik untuk mempertahankan morfologi sel. Spesimen biasanya direndam dalam larutan Bouin selama 24 jam. Namun ketika penyimpanan terlalu lama di dalam campuran ini dapat menyebabkan hidrolisis dan hilangnya DNA dan RNA. Hal ini mengharuskan jaringan yang difiksasi dengan larutan Bouin harus dilakukan pencucian terlebih dahulu sebelum di proses lebih lanjut. Penggunaan larutan Bouin ini sangat cocok ketika sediaan hendak dilakukan pewarnaan menggunakan pewarnaan Trichrome. Pewarnaan Trichrome menggunakan kombinasi tiga pewarna dengan tambahan asam phosphotungstic atau phosphomolibdic sebagai bagian dari peningkatan warna sitoplasma, serat kolagen dan komponen lainnya dari jaringan. Adapun larutan - larutan yang sering digunakan sebagai larutan fiksasi adalah sebagai berikut : 

a). Netral Bufer Formalin 10% 

1. Aquades 500ml
2. Formalin (37 % formaldehide) 100ml
3. Natrium diHidrogen Phospat (NaH2PO4) 4 gram
4. DiNatrium Hidrogen Phospat (Na2HPO4) 6.5 gram

Campurkan semua komponen menjadi satu, dan ukur hingga pH campuran sebesar 7.2-7,4. Ketika pH belum mencapai yang diharapkan maka tambahkan dengan perbandingan NaH2PO4 dan Na2HPO4 =1:1,625 hingga pH sesuai, namun kita pH terlalu basa maka bisa ditambahkan dengan asam asetat sedikit demi sedikit hingga pH turun sesuai dengan yang diharapkan. 

b).  Larutan Bouin

1. Asam pikrat 2,1% dalam aquades 1500ml
2. Formalin (37% formaldehide) 500ml
3. Asam Asetat Glasial 100ml

Efek dari penggunaan larutan fiksasi ini akan menghasilkan warna kuning. Warna kuning ini dapat dihilangkan dengan perendaman di alkohol 70%, lithium karbonat atau pewarna asam yang dibarengi atau secara terpisah pemberiannya ketika proses pewarnaan.

Sumber : Bancroft J.D, Gamble M. (2008). Theory and Practice of Histological Techniques. Philadelphia : Elsevier.