Amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction

Table of Contents

 

INFOLABMED.COM - Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang, meliputi denaturasi, annealing, dan ekstensi oleh enzim DNA polimerase. 

Taq DNA polimerase di isolasi oleh bakteri Thermus aquaticus (Taq) yang dikembangkan pada tahun 1988.

Enzim ini tahan sampai suhu mendidih 100 derajat celcius, dan aktivitas maksimalnya pada suhu 70-72 derajat celcius.

Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5' menuju ujung-3' untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang di inginkan.

Dasar siklus PCR yang utama merupakan siklus berulang 30-35 siklus, meliputi :

Denaturasi (95 derajat Celcius), 30 detik. Pada langkah ini, heliks ganda DNA terurai menjadi dua untai cetakan DNA tunggal.

Annealing (55-60 derajat celcius), 30 detik. Pada langkah ini terjadi proses pengenalan/penempelan primer cetakan DNA, suhu annealing dimulai dengan menghitung melting temperature (Tm) dari ikatan primer dan cetakan DNA, sedangkan suhu annealing (TA) adalah 5 derajat Celcius lebih kecil dari Tm primer yang sebenarnya.

Ekstensi (72 derajat Celcius). Pada langkah ini terjadi proses polimerasi untuk pembentukan untai DNA baru. Waktu yang dibutuhkan tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang digandakan sebagai produk amplifikasi. 

Peningkatan jumlah siklus PCR diatas 35 siklus tidak memberikan efek yang positif.