Penetapan Kadar Hemoglobin (HGB)

Table of Contents

Hemoglobin atau Hb adalah metaloprotein yang terkandung dalam eritrosit berfungsi sebagai pengangkut oksigen dari paru-paru ke seluruh tubuh  mahluk hidup. 

Kadar hemoglobin darah dapat ditentukan dengan berbagai macam cara. Yang banyak dipakai dalam laboratorium klinik ialah dengan cara fotoelektrik dan kolorimetrik visual.

Cara fotoelektrik: sianmethemoglobin

Darah diubah menjadi sianmethemoglobin (hemoglobin-sianida) dalam larutan yang berisi kaliumferrisianida dan kalium-sianida. 

Absorbansi larutan diukur pada gelombang 540/nm atau filter hijau. Larutan Drabkin yang dipakai pada cara ini mengubah hemoglobin, oksihemoglobin, methemoglobin dan karboksihemoglobin menjadi sianmethemoglobin. Sedangkan Sulfhemoglobin tidak berubah dan karena itu tidak ikut diukur.

Cara Kerja:

• Dimasukkan 5,0 ml larutan Drabkin kedalam tabung kolorimeter.
• Dengan pipet hemoglobin diambil 20 ul darah (kapiler, EDTA, atau oxalat); ujung pipet dibersihkan, lalu masukan darah tersebut kedalam tabung kolorimeter dengan membilasnya beberapa kali.
• Homogenkan isi tabung dengan membalikkanya beberapa kali. Tindakan ini juga dapat mengalami perubahan hemoglobin menjadi sianmethemoglobin.
• Bacalah dalam spektrofotometer pada gelombang 540 nm; digunakan larutan Drabkin sebagai blangko.
• Kadar hemoglobin ditentukan dari perbandingan absorbansinya dengan absorbansi standard sianmethemoglobin atau dibaca dari kurve tera.

Cara pembuatan kurve tera

Hitung terlebih dahulu kadar hemoglobin darah dalam larutan- larutan standard yang akan digunakan. Oleh karena larutan standard dibuat dari 20 ul darah ditambah 5,0 ml larutan Drabkin, maka itu berarti darah diencerkan 251 kali; kadar yang tertulis diampul dikali 251 = kadar hemoglobin darah dalam larutan standard.

Buatlah paling sedikit tiga kali macam larutan yang mempunyai kadar hemoglobin yang berbeda dengan cara mengencerkan larutan-larutan standard dengan larutan Drabkin, misalkan sekitar 5, 10, 15 dan 20 g/dl.

Membuat larutan dengan kadar hemoglobin terlalu tinggi tidak ada faedahnya; usahakanlah membuat larutan-larutan yang mempunyai kadar hemoglobin di sekitar nilai-nilai yang dapat di temukan dalam klinik.

Absorbansi larutan-larutan di ukur pada panjang gelombang 540 nm; digunakan larutan Drabkin sebagai blangko.

Pada kertas grafik gambarkanlah titik-titik yang diperoleh dari nilai kadar hemoglobin dan nilai absorbansi larutan-larutan itu; kadar hemoglobin pada ordinat dan absorbansi pada absisnya. Titik-titik akan membentuk garis lurus. 

Untuk membuat kurve ini gambarkanlah sebuah titik yang diperoleh dari nilai rata-rata kadar hemoglobin dan nilai rata-rata absorbansi ketiga larutan itu dan tariklah garis lurus melalui titik ini dan titik nol; ke-empat titik tera harus terletak pada garis ini.

Hitunglah faktor kurve tera ini dengan cara membagi nilai rata-rata absorbansi dengan nilai rata-rata kadar hemoglobin ke-empat larutan tersebut.

Catatan 

Cara ini sangat bagus dan sangat dianjurkan untuk penetapan kadar hemoglobin dengan teliti karena standard sianmethemoglobin yang ditanggung kadarnya bersifat stabil. Ketelitian cara ini dapat mencapai ± 2%.

Larutan Drabkin: natriumbikromat 1 g; kaliumdianida 50 mg; kaliumferridianida 200 mg, aquades 1000 ml. Adakalanya ditambahkan sedikit detergent kepada larutan Drabkin supaya perubahan menjadi sianmethemoglobin berlangsung lebih sempurna dalam waktu singkat. 

Simpan reagen ini dalam botol coklat dan perbaharuilah tiap bulan. Meskipun larutan Drabkin berisi sianida, tidak dianggap racun dalam pengertian sehari-hari karena jumlah sianida itu sangat kecil.

Kekeruhan dalam suatu sampel darah menganggu pembacaan dalam fotokolorimeter dan menghasilkan absorbansi dan kadar hemoglobin yang lebih tinggi dari yang sebenarnya. 

Kekeruhan semacam ini dapat disebabkan antara lain oleh leukositosis, lipemia dan adanya globulin abnormal seperti pada macroglobulinrmia.

Laporan hasil pemeriksaan kadar hemoglobin dengan memakai cara sianmethemoglobin dan spektrofotometri hanya boleh menyebut satu angka (digit) di belakang tanda desimal; melaporkan dua digit sesudah angka desimal melampaui ketelitian dan ketetapan yang dapat dicapai dengan metode ini. 

Variasi-variasi fisiologis juga menyebabkan digit kedua di belakang tanda desimal menjadi tanpa makna.

Cara sahli 

Pada cara ini hemoglobin diubah menjadi hematin asam, kemudian warna yang terjadi dibandingkan secara visual dengan standard.

Cara Kerja:

• Pipet HCl 0,1 N sebanyak 5 tetes sampai (skala dua) pada tabung pengencer hemometer.
• Mengisap darah (kapiler, EDTA, atau oxalat) dengan pipet hemoglobin sampai garis tanda 20 ul.
• Hapuslah darah yang melekat pada ujung luar pipet.
• Catatlah waktunya dan segera alirkan darah dari pipet ke dalam dasar tabung pengencer yang berisi HCl 0,1 N. Hati-hati jangan sampai terjadi gelembung udara.
• Angkatlah pipet itu sedikit, lalu isap asam HCl yang jernih itu ke dalam pipet 2 atau 3 kali untuk membersihkan darah yang masih tinggal dalam pipet.
• Campurlah isi tabung itu supaya darah dan asam bersenyawa; warna campuran menjadi coklat tua.
• Tambahkan aquadest setetes demi setetes, tiap kali di aduk dengan batang pengaduk yang tersedia. Persamaan warna campuran dan batang standard harus dicapai dalam waktu 3-5 menit setelah darah dan HCl 0,1 N di campur.Pada usaha mempersamakan warna hendaknya tabung diputar demikian sehingga garis bagi tidak terlihat.
• Bacalah kadar hemoglobin dengan gram/ 100 ml darah.

Kesalahan-kesalahan pada penetapan kadar hemoglobin cara sahli : 

• Tidak dapat memipet 20 ul darah.
• Darah dalam pipet tidak sempurna dikeluarkan ke dalam tabung yang berisi HCl 0,1 N karena tidak dibilas.
• Tidak baik mengaduk campuran darah dan asam pada waktu mengencerkan.
• Tidak memperhatikan waktu yang seharusnya berlalu untuk melakukan perbandingan warna.
• Terjadi gelembung udara di permukaan tabung pada waktu membaca.
• Membandingkan warna pada cahaya yang kurang stabil.
• Menggunakan tabung pengencer yang tidak diperuntukkan alat yang dipakai.

Sumber : Dian Rakyat.  Penuntun Laboratorium Klinik. Kawasan Jakarta 13930