Mengenal Teknik Teknik dalam Diagnostik Molekuler

Table of Contents

 

Sumber Gambar : Canva

INFOLABMED.COM - Sejak kloning gen eukariotik pertama tiga dekade lalu, ribuan gen eukariotik sekarang telah diisolasi. 

Proyek genom yang saat ini sedang berlangsung mengarah pada identifikasi seluruh gen pelengkap bagi banyak organisme. 

Setelah gen baru dikloning, langkah selanjutnya adalah menentukan struktur gen, bagaimana ekspresinya diatur, dan fungsi biologis dari gen yang disandikan produk.

Ekspresi gen adalah produksi protein fungsional atau RNA dari informasi genetik dikodekan dalam gen. 

Dalam arti luas, istilah ini mencakup transkripsi dan terjemahan, tetapi seringkali ekspresi gen digunakan untuk merujuk pada proses transkripsi saja. 

Ini adalah ekspresi diferensial dari gen yang mengatur perkembangan luar biasa dari satu sel menjadi organisme multisel, dan itu membedakan sel normal dari sel kanker, atau sel kulit dari sel hati. 

Dengan demikian, memahami mekanisme molekuler yang mengatur ekspresi gen merupakan bidang penting dengan implikasi yang luas.

Dunia sel hidup luar biasa kompleks. Memahami bagaimana proses molekuler dari kerja sel membutuhkan berbagai pendekatan eksperimental, mulai dari uji biokimia hingga analisis genetik untuk visualisasi mikroskopis.

Dalam bab ini, alat untuk menganalisis regulasi dan fungsi gen dijelaskan, termasuk analisis ekspresi gen pada tingkat transkripsi dan translasi. 

Selain itu, teknik untuk menganalisis interaksi DNA-protein dan protein-protein diuraikan. 

Bukan itu dimaksudkan agar bab ini dibaca terus menerus dari awal sampai akhir. 

Sebaliknya, bagian individual mungkin lebih baik digunakan sebagai sumber ketika mereka menjadi relevan untuk memahami eksperimen yang dirujuk pada atau berikutnya bab sebelumnya.

Teknik Diagnostik Molekuler

Kloning Molekuler

Dalam biologi molekuler, kloning molekuler telah digunakan sebagai alat dasar untuk menyoroti fungsi protein.

Dalam teknik ini, pengkodean DNA untuk protein yang diminati dikloning (menggunakan PCR dan/atau enzim restriksi) ke dalam plasmid (dikenal sebagai vektor ekspresi).

Vektor memiliki 3 ciri khas: asal replikasi, multiple cloning site (MCS), dan penanda selektif (biasanya resistensi antibiotik). Asal replikasi memiliki daerah promotor di hulu dari situs awal replikasi/transkripsi.

Plasmid ini dapat dimasukkan ke dalam sel bakteri atau hewan. Pengenalan DNA ke dalam sel bakteri dapat dilakukan dengan transformasi (melalui pengambilan DNA terbuka), konjugasi (melalui kontak sel-sel) atau dengan transduksi (melalui vektor virus). 

Memperkenalkan DNA ke dalam sel eukariotik, seperti sel hewan, dengan cara fisik atau kimia disebut transfeksi. 

Beberapa teknik transfeksi tersedia dan ini termasuk transfeksi kalsium fosfat, elektroporasi, mikroinjeksi dan transfeksi liposom. 

DNA juga dapat dimasukkan ke dalam sel eukariotik menggunakan virus atau bakteri (Agrobacterium tumefaciens) sebagai pembawa; yang terakhir kadang-kadang disebut baktofeksi. 

Plasmid dapat diintegrasikan ke dalam genom, menghasilkan transfeksi yang stabil, atau mungkin tetap independen dari genom dan ini disebut sebagai transfeksi transien. 

Dalam kedua kasus tersebut, pengkodean DNA untuk protein yang diinginkan ada di dalam sel, dan protein tersebut dapat diekspresikan.

Dalam kloning molekuler, berbagai sistem termasuk promotor yang dapat diinduksi dan faktor pensinyalan sel spesifik, tersedia untuk membantu mengekspresikan protein yang diinginkan pada tingkat tinggi.

Sejumlah besar protein kemudian dapat diekstraksi dari sel bakteri atau eukariotik.

Ekstraksi berikut adalah uji aktivitas enzimatik setelah protein dikristalisasi untuk mempelajari struktur tersiernya serta aktivitas obat baru terhadapnya.

Blotting Makromolekul dan Probing 

“Blotting,” adalah istilah yang mengacu pada proses mendeteksi keberadaan dan kuantitas DNA, RNA, atau protein dalam sel. 

Teknik blotting dan probing pertama kali dijelaskan oleh Edwin Southern (1973) untuk hibridisasi DNA blotting. 

Pada tahun 1984, Patricia Thomas mengembangkan bercak RNA dan ini dikenal sebagai bercak utara. 

Modifikasi dan kombinasi lebih lanjut dari protokol ini memunculkan teknik lain seperti barat daya (hibridisasi protein-DNA), barat laut (untuk mendeteksi interaksi protein-RNA) dan barat jauh (interaksi protein-protein), seperti yang dilaporkan dalam literatur.

Northern blotting: Dalam north blotting, struktur dan kuantitas RNA ditekankan dalam kaitannya dengan pola ekspresi mereka di antara sampel RNA yang berbeda.

Ini adalah salah satu alat paling dasar untuk menentukan waktu, level dan kondisi gen tertentu yang diekspresikan dalam jaringan hidup. 

Protokol melibatkan penggunaan kombinasi elektroforesis gel RNA denaturasi dan blot. Dalam teknik ini, RNA dipisahkan berdasarkan ukurannya. RNA yang dipisahkan kemudian dipindahkan ke membran yang diperiksa dengan komplemen berlabel dari urutan yang diinginkan. 

Hasil yang divisualisasikan dalam pembentukan pita mewakili ukuran RNA yang terdeteksi sedangkan intensitas pita ini terkait dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis . 

Prosedur ini biasanya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur jumlah RNA yang ada dalam sampel yang berbeda. Kerugian utama dari teknik north blot adalah sensitivitasnya yang buruk dan konsumsi waktu yang tinggi karena penggunaan probe oligonukleotida DNA tradisional. 

Ini telah diatasi dengan mengadopsi protokol improvisasi analisis miRNA yang melibatkan ekstraksi RNA, elektroforesis gel poliakrilamida dengan blotting utara, dan deteksi probe oligonukleotida termodifikasi locked nucleic acid (LNA) dengan hibridisasi.

Western blotting: Pada western blotting, deteksi protein dilakukan terlebih dahulu diikuti dengan pemisahan berdasarkan ukuran dan berat molekul menggunakan gel tipis yang diapit di antara dua pelat kaca. 

Teknik ini disebut sebagai sodium dodecyl  sulfate  polyacrylamide  gel  electrophoresis (SDS-PAGE). 

Protein dalam gel kemudian dipindahkan ke membran pendukung yang diperiksa dengan larutan antibodi berlabel enzim. 

Membran pendukung ini termasuk polyvinylidene fluoride (PVDF), nitroselulosa, nilon dll [8]. Kekhususan pengikatan antibodi-protein divisualisasikan oleh produk berwarna (chemiluminescence) atau autoradiografi.

Namun, penggunaan teknik western blotting tidak hanya memungkinkan deteksi tetapi juga analisis kuantitatif.

Eastern blotting: Teknik Eastern blotting adalah modifikasi dari western blot yang melibatkan deteksi enzimatik dari protein pasca-translasi. 

Protein yang menempel pada membran PVDF atau nitroselulosa diperiksa untuk modifikasi menggunakan substrat spesifik.

Elektroforesis Gel 

Elektroforesis gel adalah salah satu alat dasar biologi molekuler. Istilah "elektroforesis" awalnya dimaksudkan untuk merujuk pada migrasi partikel molekul bermuatan dalam medan listrik, terutama melintasi membran. 

Namun, migrasi zat dengan berat molekul lebih rendah dalam media yang distabilkan seperti gel dan bubuk disebut sebagai "ionoforesis".

 Prinsip dasarnya adalah melalui medan listrik dan ukuran, DNA, RNA, dan protein semuanya dapat dipisahkan. 

Dalam elektroforesis gel agarosa, DNA dan RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menjalankan zat melalui gel agarosa bermuatan listrik.

Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode revolusioner yang dikembangkan pada tahun 1983 oleh Kary Mullis. 

PCR telah terbukti menjadi metode yang berharga dan tetap menjadi teknik molekuler yang paling sering digunakan di laboratorium patologi molekuler dan merupakan teknik yang sangat serbaguna untuk menyalin DNA dengan bantuan DNA polimerase. 

Dalam teknik ini, penyalinan atau modifikasi yang telah ditentukan sebelumnya dari sekuens DNA spesifik dan identifikasi fragmen DNA tertentu dalam perpustakaan cDNA ditingkatkan oleh enzim DNA polimerase, yang memperkuat fragmen spesifik dari molekul DNA target yang ditambahkan ke dalam reaksi. 

Nukleotida ini dinamakan sebagai primer dan mengandung sekuen yang melengkapi sekuens target dari molekul DNA target. 

Teknik PCR juga dapat digunakan untuk memperkenalkan situs enzim restriksi ke ujung molekul DNA, atau untuk mengubah basa DNA tertentu (disebut sebagai site-directed mutagenesis)

Urutan reaksi dalam PCR sangat kuat sehingga amplifikasi molekul DNA menghasilkan sekitar 1 miliar molekul dalam waktu singkat (kurang dari 2 jam) karena reaksi dilakukan dalam kondisi sempurna.

PCR memiliki variasi seperti reverse transcription PCR (RT-PCR) untuk amplifikasi RNA dan PCR kuantitatif yang memungkinkan pengukuran kuantitatif molekul DNA atau RNA. 

Beberapa salinan gen chimeric yang ditargetkan dapat diperoleh dengan menggunakan sepasang urutan komplementer primer (primer oligonukleotida) bersama dengan polimerase tahan panas yang unik (enzim penyalin DNA).

Multiplex PCR (mPCR) yang digunakan untuk identifikasi simultan beberapa sekuens gen yang berasal dari patogen yang sama atau berasal dari campuran patogen yang berbeda.

Setiap siklus PCR melibatkan 3 langkah dasar: denaturasi, anil (atau hibridisasi), dan polimerisasi. 

Selama denaturasi, 2 helai heliks dari materi genetik target (DNA) dilepaskan dan dipisahkan dengan pemanasan pada suhu 90° hingga 95°C. 

Selama anil, ada pengikatan primer oligonukleotida ke basa komplementernya pada DNA beruntai tunggal. 

Langkah ini membutuhkan suhu yang jauh lebih dingin, 55°C. Akhirnya, selama polimerisasi (pada 75°C), untai cetakan dibaca oleh polimerase dan dipasangkan dengan cepat dengan nukleotida yang sesuai, menghasilkan 2 heliks baru yang terdiri dari bagian untai asli dan untai komplementer yang baru saja dirakit. 

Proses ini diulang 30 sampai 40 kali, dengan menggandakan jumlah materi genetik yang ditargetkan dalam setiap siklus.

Pada akhir prosedur, banyak salinan identik (dalam jutaan) dari sekuens DNA spesifik asli akan diproduksi. 

Salinan diharapkan untuk bermigrasi secara bersamaan ketika mengalami elektroforesis untuk membentuk pita tunggal karena kesamaan muatan listrik dan berat molekul. 

Spesifisitas uji PCR ditentukan oleh urutan DNA target yang dievaluasi, urutan dari probe oligonukleotida, urutan serupa yang mungkin ada di tempat lain di alam dan maksud dari perancang pengujian.

 Metode amplifikasi alternatif yang ada termasuk Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP), Low-Stringency Single-Specific-Primer (LSSCP), Ligase Detection Reaction (LDR), Ligase Chain Reaction (LCR) dan Single Stand Conformation Polymorphism (SSCP).

Fluorescent In Situ Hybridization

Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) dikembangkan oleh peneliti biomedis pada 1980-an, dan didasarkan pada penggunaan probe oligonukleotida berlabel Fluoresensi  yang secara khusus menempel pada target sekuens DNA komplementernya pada genom dan wilayah tersebut diberi label.

Dengan warna Fluoresensi (misalnya, merah Texas, hijau FITCI, oranye akridin). Wilayah berlabel kemudian dapat divisualisasikan di bawah mikroskop Fluoresensi. Ada 3 jenis probe yang digunakan secara luas:

• Painting  probes: melalui pemasangan lukisan probe ke urutan tumpang tindih pada kromosom target (misalnya, kromosom 17), kromosom diidentifikasi sebagai "lukisan" berdasarkan warna Fluoresensi yang dipilih.
• Probe sentromerik yang mengidentifikasi wilayah sentromerik dari kromosom tertentu dan dengan demikian membantu menghitung jumlah salinan kromosom tersebut bahkan dalam keadaan interfase sel yang tidak membelah).
• Probe spesifik alel yang mengikuti urutan alel target spesifik seperti gen penekan tumor p53 atau onkogen HER2/neu.

FISH menawarkan keuntungan besar dibandingkan sitogenetika konvensional dalam studi penghapusan dan translokasi kromosom, dan amplifikasi gen. 

Sitogenetika konvensional memerlukan langkah kultur sel yang memakan waktu dan hanya dapat dilakukan dengan sampel jaringan segar. 

FISH cepat dan sensitif dan dapat digunakan sebagai alat pelengkap dalam diagnostik genetik karena dapat dilakukan pada sel dalam tahap pembelahan (metafase) dan istirahat (interfase), jaringan beku segar serta apusan sitologi arsip atau bagian jaringan yang tertanam parafin.

Ths juga memungkinkan FISH untuk digunakan dalam diferensiasi sinyal dari sel dalam kondisi sehat dan kanker serta dalam peningkatan "sitogenetika interfase" pada pengaturan tumor dan prenatal.

FISH sering digunakan dalam interpretasi penyimpangan kromosom numerik dan kompleks dan evaluasi amplifikasi onkogen HER2/neu pada karsinoma payudara dan untuk mendeteksi translokasi yang berbeda pada leukemia myelogenous kronis dan leukemia myelogenous akut.

Spectral Karyotyping Imaging

Spectral Karyotyping Imaging (SKI) adalah teknik sitogenetik, yang dikembangkan oleh Schrock et al., (1996), dan menggabungkan dua prinsip dasar FISH yaitu pewarnaan kromosom dan fluoresensi multiwarna. 

Ini melibatkan penggunaan 24 set probe "lukisan" khusus kromosom. SKI didasarkan pada pelabelan masing-masing probe dengan berbagai proporsi lima fluorochromes, berbeda dikombinasikan untuk setiap kromosom tertentu dalam cahaya emisi spektral yang unik.

 Hal ini memungkinkan tampilan dan identifikasi semua 24 kromosom manusia  ditetapkan dalam warna berbeda dalam satu metafase, dengan menggunakan kombinasi pelabelan probe, mikroskop Fluoresensi, spektroskopi, pencitraan CCD dan analisis gambar spektral tanpa pengetahuan sebelumnya tentang kelainan yang terlibat.

Teknologi ini memungkinkan penggunaan “interferometer” yang mirip dengan yang digunakan oleh para astronom untuk membedakan spektrum cahaya yang dipancarkan oleh bintang yang berbeda. 

Sedikit variasi warna, tidak terdeteksi oleh mata manusia, terdeteksi oleh perangkat komputerisasi ini. Ini kemudian menetapkan kembali warna visual (warna klasifikasi) yang mudah dibedakan untuk setiap pasangan kromosom. 

Manfaat dari pendekatan ini termasuk analisis yang akurat dari kariotipe abnormal (kelainan kromosom numerik), tidak terselesaikan oleh sitogenetika konvensional dan kemampuan untuk mengidentifikasi translokasi samar dalam kariotipe yang tampaknya 'normal' (pergeseran bagian kromosom berwarna). 

SKI juga digunakan untuk membagi sel dalam metafase sehingga melengkapi sitogenetika konvensional. 

Selanjutnya, translokasi kompleks yang terjadi pada sel tumor (misalnya, sel kanker payudara) dapat diselesaikan dengan SKI, mengarah ke analisis "kromosom penanda" yang terdiri dari campuran fragmen dari kromosom yang berbeda.

Terlepas dari kepentingan analitis SKI, keterbatasan berikut telah dilaporkan:

Abnormalitas struktural seperti inversi, delesi, insersi, dan duplikasi pada kromosom yang sama ditunjukkan dengan warna yang sama sehingga tidak mungkin untuk dinilai.

Juga, segmen Q-positif dan daerah satelit lengan panjang kromosom Y dekat sentromer tidak dapat dideteksi [35].

Batas resolusi deteksi sekitar 1-2 Mb, mirip dengan teknik lukisan kromosom konvensional, dan kelainan struktural minor kurang dari 1 pita tidak dapat dideteksi. 

Oleh karena itu, verifikasi lokasi kerusakan kromosom memerlukan penggunaan SKI terlebih dahulu dalam kombinasi dengan G-banding atau pita kromosom beresolusi tinggi, alih-alih menggunakan SKI saja untuk mengamati pola pita secara makroskopik.

Selain itu, pengembangan teknik pita warna spektral telah mengatasi keterbatasan SKI  dan teknik ini menggabungkan pewarnaan diferensial G-band dengan teknologi pewarnaan SKI. 

Penggunaan klinis yang luas dari SKI di bidang genetika klinis telah memberikan kontribusi yang signifikan dalam diagnosis gangguan molekuler tetapi biaya teknik ini masih tetap menjadi kelemahan.

Sumber : https://www.researchgate.net/publication/342364804_Diagnostic_Techniques_in_Molecular_Biology_-An_Overview 

Ikuti berita terkini dengan mengikuti kami di Google News atau klik tautan ini Google News INFOLABMED.