Langkah-Langkah Persiapan Reagen Gram Stain

Table of Contents

 

INFOLABMED.COM - Pewarnaan Gram atau Gram stain adalah metode pewarnaan bakteri yang banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi untuk membantu dalam identifikasi jenis bakteri. 

Metode ini ditemukan oleh ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram, pada tahun 1884. 

Pewarnaan Gram digunakan untuk membedakan dua kelompok utama bakteri, yaitu Gram-positif dan Gram-negatif, berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Prinsip Pewarnaan Gram

Pada dasarnya, Gram stain bekerja dengan menggunakan serangkaian bahan kimia yang mengubah warna bakteri sesuai dengan struktur dinding sel mereka. 

Baca juga : Uji Kultur Bakteri

Bakteri dengan dinding sel tebal yang terdiri dari lapisan peptidoglikan akan menyerap zat pewarna utama dan tetap berwarna ungu setelah proses pewarnaan selesai (Gram-positif). 

Sedangkan bakteri dengan lapisan dinding sel yang lebih tipis akan kehilangan warna ungu dan berubah menjadi merah atau merah muda setelah diperlakukan dengan pewarna kontras (Gram-negatif).

Pentingnya Metode Pewarnaan Gram dalam Identifikasi Bakteri

Metode pewarnaan Gram sangat penting dalam diagnosa infeksi bakteri. Dengan membedakan bakteri menjadi kelompok Gram-positif dan Gram-negatif, petugas laboratorium dapat memberikan informasi awal kepada dokter mengenai jenis infeksi yang diderita pasien. 

Informasi ini membantu dalam memilih antibiotik yang efektif untuk pengobatan.

Langkah-Langkah Persiapan Reagen Gram Stain

Berikut adalah cara menyiapkan beberapa reagen penting dalam prosedur Gram stain yang digunakan di laboratorium.

Baca juga : Fungsi Kristal Violet dalam Pewarnaan Gram: Peran Penting dalam Identifikasi Mikroorganisme

A. Persiapan Crystal Violet

1. Larutan Stok Crystal Violet

• Bahan: crystal violet (90-95% kadar pewarna) sebanyak 40 gram, etanol 95% sebanyak 400 ml.
• Prosedur: Larutkan crystal violet dalam etanol di dalam botol kaca, yang mungkin memerlukan waktu semalaman untuk larut sepenuhnya. Setelah larut, beri label dengan tanggal kadaluwarsa satu tahun, dan simpan pada suhu ruangan.

Peringatan: Etanol adalah zat yang mudah terbakar, jadi perlu berhati-hati dalam penanganannya.

2. Larutan Ammonium Oksalat (1%)

• Bahan: ammonium oksalat (reagen grade) sebanyak 16 gram, air suling sebanyak 1.600 ml.
• Prosedur: Larutkan ammonium oksalat dalam air di botol kaca cokelat, beri label dengan tanggal kadaluwarsa satu tahun, dan simpan pada suhu ruangan.

3. Larutan Kerja Crystal Violet

• Bahan: larutan stok crystal violet sebanyak 40 ml, larutan ammonium oksalat (1%) sebanyak 160 ml.
• Prosedur: Saring larutan stok crystal violet ke dalam botol kaca, lalu tambahkan larutan ammonium oksalat yang telah disaring. Beri label dengan tanggal kadaluwarsa paling awal dari larutan stok yang digunakan.

B. Gram’s Iodine

1. Larutan Stok Lugol’s Iodine

• Bahan: kristal iodine (reagen grade) sebanyak 25 gram, kalium iodida (reagen grade) sebanyak 50 gram, air suling sebanyak 500 ml.
• Prosedur: Larutkan kedua bahan dalam air dan simpan dalam botol kaca cokelat, beri label dengan tanggal kadaluwarsa enam bulan, dan simpan pada suhu ruangan.

2. Sodium Bicarbonate 5%

• Bahan: sodium bikarbonat (NaHCO3) sebanyak 50 gram, air suling sebanyak 1.000 ml.
• Prosedur: Larutkan sodium bikarbonat dalam air dan simpan dalam botol kaca, beri label dengan tanggal kadaluwarsa satu tahun, dan simpan pada suhu ruangan.

Peringatan: Iodine dan kalium iodida bersifat korosif. Hindari kontak dengan kulit serta inhalasi dan jangan simpan di dekat asam.

3. Larutan Gram’s Iodine

• Bahan: larutan stok Lugol’s iodine sebanyak 60 ml, air suling sebanyak 220 ml, larutan sodium bikarbonat 5% sebanyak 60 ml.
• Prosedur: Campurkan semua bahan dalam botol kaca cokelat, beri label dengan tanggal kadaluwarsa enam bulan, dan simpan pada suhu ruangan.

C. Counterstains (Pewarna Kontras)

1. Safranin

a. Larutan Stok Safranin

• Bahan: safranin O sebanyak 5 gram, etanol 95% sebanyak 200 ml.
• Prosedur: Larutkan safranin dalam etanol di dalam botol kaca dan beri label dengan tanggal kadaluwarsa satu tahun. Simpan pada suhu ruangan.

Peringatan: Etanol mudah terbakar, sehingga perlu berhati-hati dalam penyimpanan dan penanganan.

b. Larutan Kerja Safranin

• Bahan: larutan stok safranin sebanyak 20 ml, air suling sebanyak 180 ml.
• Prosedur: Campurkan kedua bahan dalam botol kaca dan beri label dengan tanggal kadaluwarsa satu tahun. Simpan pada suhu ruangan.

2. Fuchsin Dasar (Basic Fuchsin)

• Bahan: fuchsin dasar (reagen grade) sebanyak 1, 2, atau 8 gram, alkohol etil sebanyak 100 ml, air suling sebanyak 900 ml.
• Prosedur: Masukkan fuchsin dasar ke dalam botol kaca cokelat, tambahkan alkohol etil dan biarkan semalaman. Setelah itu, saring menggunakan kertas saring Whatman no. 1, tambahkan air suling. Beri label dengan tanggal kadaluwarsa satu tahun dan simpan pada suhu ruangan.

Pentingnya Keamanan dalam Penyiapan Reagen

Penyiapan reagen untuk Gram stain memerlukan perhatian khusus, terutama dalam penggunaan bahan kimia yang mudah terbakar atau korosif seperti etanol dan phenol. 

Penggunaan peralatan pelindung diri dan penanganan yang tepat sangat penting untuk menghindari kecelakaan di laboratorium.***